【正文】 。蛋白溶液的保存原則：（1）緩沖液pH 避免接近蛋白的等電點(diǎn)；（2）根據(jù)每次使用的量分裝成多管，這樣可避免反復(fù)凍融；（3）加入穩(wěn)定劑如甘油，DTT, TritonX100等。目前后兩種常用的定量方法都有相關(guān)的試劑盒采用。改良的Lorry法不再排斥去污劑，相對(duì)的操作就比較復(fù)雜。一般而言，紫外吸收法適合于與色譜柱聯(lián)用，達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控，然而較不準(zhǔn)確。（3）Lorry法其原理是蛋白質(zhì)與堿性銅溶液中的Cu2+絡(luò)和使得肽鍵伸展，從而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在堿性銅條件下與福林試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色，在一定濃度范圍內(nèi)，其顏色的深淺與蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各種蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在測(cè)定時(shí)需使用同種蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)。該法測(cè)定要求樣品中不能有能與考馬斯亮藍(lán)G250反應(yīng)顯色的去污劑，比如Triton、NP400、吐溫等。其原理為，蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G250結(jié)合，使得染料最大吸收峰從465nm變?yōu)?95nm，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測(cè)定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)行蛋白定量。例如，在制備酶的過程中，層析柱的流出液中有時(shí)混雜有核酸，應(yīng)予以校正。首先，對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差，故該法適于測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。因此，已在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中廣泛采用，尤其在柱層析分離純化中，常用280nm進(jìn)行紫外檢測(cè)，來(lái)判斷蛋白質(zhì)吸附或洗脫情況。（1）直接紫外吸收法由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，所以任何一個(gè)蛋白質(zhì)都具有280nm附近的紫外吸收峰，在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光密度OD280nm與其濃度呈正比關(guān)系，我們可以對(duì)其進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)的快速定量方法主要依靠蛋白質(zhì)本身的發(fā)色基團(tuán)，或其與其它顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生的紫外吸收來(lái)進(jìn)行定量。定量作為生物實(shí)驗(yàn)室的日常工作之一，具有非常重要的意義。根據(jù)干膠的吸水量和蛋白液需濃縮的倍數(shù)而稱取所需的干膠量。另一種是將蛋白液裝入透析袋內(nèi)置于真空干燥器的通風(fēng)口上，負(fù)壓抽氣，而使袋內(nèi)液體滲出。（3）超濾膜濃縮法此法是利用微孔纖維素膜通過高壓將水分濾出，而蛋白質(zhì)存留于膜上達(dá)到濃縮目的。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便，應(yīng)用時(shí)可配成任意濃度使用。密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態(tài)。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。吸水劑用過后，可放入溫箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。將要濃縮的蛋白溶液放入透析袋（無(wú)透析袋可用玻璃紙代替），結(jié)扎，把高分子（6 000～12 000）聚合物如聚乙二醇（碳蠟）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。（4）可在細(xì)胞質(zhì)或周質(zhì)中表達(dá)（pMALp2X載體）：周質(zhì)表達(dá)可提高二硫鍵的形成，促進(jìn)蛋白折疊的形成?！緋MAL系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)】（1）75%的蛋白可獲得高效表達(dá)，蛋白產(chǎn)量可達(dá)100 mg/L （2）與其他幾種常用表達(dá)系統(tǒng)研究比較，與MBP融合表達(dá)更能提高E. coli表達(dá)蛋白的可溶性。（3）預(yù)裝柱在每次使用完畢后，在柱床上方加入2～4 ml 緩沖液或水，蓋上頂端的帽子后，隨即蓋上底部的帽子，豎立放置于4℃貯存。 Amylose樹脂可以采用下述清洗步驟進(jìn)行再生水3倍柱床體積% SDS3倍柱床體積水1倍柱床體積過柱緩沖液3倍柱床體積【注意事項(xiàng)】（1）每次使用時(shí)，請(qǐng)先打開頂端的帽子再移去底部的帽子，以避免氣泡進(jìn)入到預(yù)裝柱內(nèi)。再生。通常，含目的蛋白的融合蛋白在一個(gè)柱床體積內(nèi)將被洗脫下來(lái)，可以通過波長(zhǎng)為280 nm的紫外吸收光或考馬斯亮藍(lán)蛋白檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)。用4倍柱床體積的洗脫緩沖液洗脫與Amylose樹脂結(jié)合的MBP融合蛋白，～1 ml/min。（2）融合蛋白的親和純化：預(yù)裝柱用8～12倍柱床體積的雙蒸水沖洗；預(yù)裝柱用9倍柱床體積過柱緩沖液平衡；將上述實(shí)驗(yàn)步驟三的上清液加入到柱床內(nèi)，～1 ml/min（建議每次上樣2～4ml）。添加劑：1 mM sodiμm azide；10 mM β－mercaptoethanol 或1 mM DTT。C貯存。結(jié)合容量： mg MBPParamyosin 融合蛋白。所有這些載體都含有一段編碼蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，融合蛋白純化后，通過Factor Xa（X），Enterokinase（E）或GenenaseTM I（G）可將目的蛋白與MBP切割分離。pMALTMc2 系列載體缺失malE 信號(hào)序列，導(dǎo)致融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)?！　?此系統(tǒng)的pMAL載體含有LacZα基因，目的基因的插入導(dǎo)致其失活，通過Xgal平板可進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。pMAL載體含有編碼麥芽糖結(jié)合蛋白（Maltose Binding Protein, MBP）的大腸桿菌malE基因，其下游的多克隆位點(diǎn)便于目的基因插入，表達(dá)N端帶有MBP的融合蛋白。操作過程中目標(biāo)蛋白降解：控制操作條件，比如嚴(yán)格4℃操作，緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，超聲處理過度：減少超聲，避免發(fā)泡導(dǎo)致蛋白變性。洗脫條件：可已在洗脫緩沖液中加入一定量的非離子去污劑，%的Triton100 或NP40等。（3）純化的蛋白雜質(zhì)很多表達(dá)的蛋白不完整：再遇到一些稀有密碼子或者特殊的RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可能使得目標(biāo)蛋白截短表達(dá)，可采用一些特殊的表達(dá)宿主，如Rosetta系列。每次在臨純化前新鮮配制1X洗脫緩沖液洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低：GST?Bind樹脂的還原型谷胱甘肽濃度達(dá)到10mM就夠了。（2）蛋白難以洗脫洗脫體積太少：有時(shí)需要使用更多的緩沖液洗脫目的蛋白。采用溫和的超聲條件或改用其它的破碎方法。融合蛋白與GST?Bind樹脂會(huì)結(jié)合不充分。樹脂可以在4℃下，20%乙醇/80%水中長(zhǎng)時(shí)間存放。其它可以選用做去除污染蛋白的緩沖液還包括：6M尿素，6M鹽酸胍或低極性溶劑，如50～70%乙醇或50%乙二醇。但隨著非特異性結(jié)合的蛋白的增多和蛋白的聚集，往往會(huì)造成流速和結(jié)合載量都下降?？梢詫?duì)操作過程中的每一步取樣進(jìn)行SDSPAGE分析。方法二：是純化不含GSTtag 的蛋白，按照說(shuō)明書將蛋白酶PreScission Protease（GE公司）用PBS 稀釋到到1ml，加入到（6）中的樹脂中，輕輕混勻然后4℃溫育12h，收集流出液，即為GFP的純化產(chǎn)物。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要不同有兩種方法來(lái)收集目的蛋白。（6）重復(fù)步驟（5）一次，然后向沉淀中加入5ml 的PBS 懸浮樹脂，并將懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)10ml 的塑料層析柱，并打開閥門放掉PBS。（4）2000 rpm，離心5min，小心傾倒出上清。（2）用寬嘴吸頭吸取1ml 的脂漿，加入到裝有40ml 的PBS(整個(gè)操作過程所有的PB均需預(yù)冷) V型離心管中，輕柔顛倒數(shù)次，洗滌除去殘留的20%乙醇，2000 rpm，離心5min，小心傾倒出PBS。蛋白的誘導(dǎo)與樣品的制備方法基本同上。非常適合實(shí)驗(yàn)室小量制備大腸桿菌重組蛋白。用1ml 的樹脂純化1L ～ mg。GST 融合于目標(biāo)蛋白的N端，可以通過谷胱甘肽瓊脂糖親和層析進(jìn)行純化。（15）如果想長(zhǎng)期儲(chǔ)存，加入1倍體積的20%乙醇，4度保存，使用前需要執(zhí)行步驟14。（13）用3倍體積的去離子水洗。（11）用1倍體積的去離子水洗。（9）用1倍體積的50%乙醇洗。（7）用5倍體積的100%乙醇洗。（5）用1倍體積的50%乙醇洗。（3）用3倍體積的2% SDS洗。NTA再生步驟：（1）從層析柱下端流干所有溶液， Acetic Acid/6M gμanidine HCl 洗。注意：NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計(jì)出NTA的樹脂體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋?，在等上一再生溶液流干后，再加下一再生溶解。策略：增加洗滌的次?shù),使洗滌充分。可能原因3：雜質(zhì)和標(biāo)簽蛋白結(jié)合在一起。策略2：篩選最適合的緩沖液條件，NaCl濃度，PH的范圍都需要進(jìn)行篩選，以便決定最適的結(jié)合和洗脫條件。策略1：咪唑濃度必須優(yōu)化，以確保高純度（宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的低結(jié)合）和高產(chǎn)率（組氨酸標(biāo)記的目標(biāo)蛋白質(zhì)的強(qiáng)結(jié)合）之間的最佳平衡。策略：請(qǐng)?zhí)砑拥鞍酌敢种苿?，（慎用EDTA）。策略：加非離子去污劑到洗脫緩沖液（如，2%Triton X100）或增加NaCl的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度，或在變性條件(去折疊)下洗脫(用4～8 M脲，或4～6 M 鹽酸胍)。