【正文】 TP ，終濃度一般為 200mM（即飽和濃度）。 85 4． 模板 模板的數量會直接影響擴增的效果。 86 5． DNA 聚合酶 ① Taq DNA 聚合酶 來自嗜熱古細菌的嗜熱水生菌（ Thermus aquaticus） ， Taq DNA 聚合酶分子量大小為 94kDa ，為單分子酶，在 75℃ 活性最強。339。在 95℃ 的半衰期為 40 分鐘。 外切活性，在擴增過程中有 11x10 5 的錯配幾率。 88 （三） PCR反應程序 1．常規(guī)程序 預變性 : 9496℃ 幾十秒至幾分鐘 變性： 94℃ 、 30 秒鐘 退火： 5065℃ 、 30 秒鐘； 25～ 35 次循環(huán) 延伸： 72℃ 、 1 分鐘 72℃ 保持 37min 4℃ 保存 89 2．復性（退火）和延伸溫度 復性的溫度是 PCR 擴增是否順利的關鍵因素，通常在 5060℃ 之間。 90 3．反應時間 變性步驟一般使用 30 秒鐘，如果模板的 G+C 含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長。 ?平臺效應（ plateau effect）： PCR 擴增過程后期會出現的產物的積累按減弱的指數速率增長的現象。早期的 PCR 儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。在遇到這個問題時，如果將反應成分分開配制， A 管含模板、引物和 dNTP ，以及調整體積的 H2O ， B 管含緩沖液、 DNA 聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。只有當 PCR 反應進入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起。 二、基因組文庫的構建與基因克隆 101 基因組 DNA文庫 從生物組織細胞提取出全部DNA ，用物理方法或酶法將 DNA降解成預期大小的片段，然后將這些片段與適當的載體連接，轉入受體細菌或細胞，這樣每一個細胞接受了含有一個基因組 DNA片段與載體連接的重組 DNA分子，而且可以繁殖擴增，許多細胞一起組成一個含有基因組各 DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組 DNA文庫 。其復雜性比基因文庫低得多。 4)第二條 cDNA鏈的合成 5) cDNA的甲基化和接頭的加入 6)雙鏈 cDNA與載體的連接 108 互補DNA的合成原理 mRNA分子的 3’末端都有poly(A)尾巴 ,可以與結合寡聚核苷酸 [oligo(dT)]的惰性物質結合 ,并得以分離 ① 1220個寡聚核苷酸的oligo(dT)作為引物，合成第一個 cDNA鏈 ② 隨機引物法 切割常損失需要的 cDNA 形成發(fā)卡環(huán)的機理不清楚 第一條 cDNA 第二條 cDNA 109 基因組DNA文庫及cDNA文庫的建立 110 根據研究目的，選擇克隆策略 ?控制基因表達的調控序列 ?mRNA中不存在的特定序列 DNA libary 蛋白質的氨基酸序列 cDNA 111 堿基對 106 107 108 109 1010 玉米 人 果蠅 酵母 物 種 大腸桿菌 5 109bp 109bp 108bp 107bp 4 106bp 112 1967年 Khorana提出化學合成基因的想法 ，并進行了實踐 。 ?整個 DNA的化學合成過程可以在一個反應柱上連續(xù)進行 ， 并且可以對合成過程進行計算機控制 。 基因克隆的受體細胞 ， 從實驗技術上講 ， 是能攝取外源 DNA(基因 )并使其穩(wěn)定維持的細胞 ， 從實驗目的上講 ， 是有理論研究價值和應用價值的細胞 。 *真核生物的載體有：動物病毒 （一）粘性末端連接法 相同限制酶切位點連接 同一限制性內切酶切割不同的 DNA ，具有相同粘性末端。 連接效率低，一般只有粘性末端的 1%。 補充內容：受體細胞選擇的一般原則 原核生物 動物細胞 119 目前已使用的受體細胞有三大類： （ 1） 微生物表達系統(tǒng) 最早使用和至今最廣泛使用的是 大腸桿菌 ， 其次是 酵母和枯草桿菌 。 120 選用克隆載體時注意： 1)為使導入的目的基因能在受體的細胞中有效表達 ， 應選用具有強啟動子的表達載體 。 原核細胞的轉化過程就是一個導入外源 DNA的過程 。 為制備感受態(tài)細胞 ， 應注意以下幾點： (1)在最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)受體細胞至對數生長期 ， 培養(yǎng)時一般控制受體細胞密度 OD600在 ； (2)制備的整個過程控制在 0～ 4℃ (3)為提高轉化率 ， 可選用復合 CaCl2溶液 。 磷酸鈣轉染法的基本原理 ：哺乳動物細胞能捕獲粘附在細胞表面的 DNA磷酸鈣沉淀物 ， 使 DNA轉入細胞 。 126 應用對象 ：酵母細胞以及其它真菌細胞 。 原理 ：細胞膜表面帶負電荷 ， 脂質顆粒帶正電荷 ， 以電荷間引力將 DNA、 mRNA及單鏈 RNA導入細胞內 。 利用這一特性 ， 先將含 目的基因的外源 DNA同鎢 、 金等金屬微?；旌?，使 DNA吸附在金屬微粒表面 ， 隨后用基因槍轟擊 ， 通過氦氣沖擊波使 DNA隨高速金屬微粒進入植物細胞 ， 此方法可直接處理植物器管或組織 ， 是當今普遍應用的 植物轉基因 方法 。 131 8 .激光微束穿孔法 利用直徑很小 、 能量很高的 激光微束 可引起細胞膜可逆性穿孔的原理 ， 用激光處理細胞 ， 處于細胞周圍的 重組 DNA隨之進入細胞 。 這一成果被認為對今后有目的地培養(yǎng)供人體所用的移植器官具有重要意義 。這種基因可以編碼生成發(fā)出綠光的蛋白質。 134 目前重組體篩選的方法很多 ， 概括起來有三類： （ 1） 生物學方法：包括遺傳學方法 、 免疫學方法和噬菌斑的形成等； （ 2） 核酸雜交：通過 DNADNA、 DNARNA堿基配對的原理進行篩選 ， 以探針的使用為核心 ， 包括 原位雜交 、 Southen雜交 、 Northen雜交等 ； （ 3） 物理方法：如用電泳法等 。 * 通過標記的探針 DNA與靶 DNA結合，檢測目的基因的存在及大小。 * 細菌菌落的原位雜交：篩選陽性克隆。 142 五、序列測定 Sanger等（ 1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法。轉基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快 2～3倍，體積大一倍。 一、概念 146 顯微注射法： 將 DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過 DNA的胚胎移植到動物體內，使之發(fā)育成正常的幼仔。 the smaller, uninjected control weighs 29g. 148 3．逆轉錄病毒感染法： 最早用來得到轉基因小鼠的方法，利用逆轉錄載體將遺傳信息以 RNA分子的形式，在逆轉錄整合酶和逆轉錄基因組末端的特異性核酸序列的作用下，反轉錄并整合到宿主基因組中去，最終得到轉基因小鼠。 改善動物生產性能，提高動物育種效率。 什么是生物反應器？ 151 生物反應器的種類及應用 用于表達的生物反應器包括動物血液、泌尿系統(tǒng)、精囊腺、乳腺等，還包括禽蛋和昆蟲（例如家蠶）個體等。 美國占６６％，達３９００萬公頃，轉基因作物產量也居世界第一，美國種植的７５％的大豆、３４％的棉花和７１％的玉米都是轉基因作物。 歐盟國家總面積不到２０萬公頃，０ .３％左右。 由于早衰問題，人們 懷疑“多莉是穿著羔羊服裝的老羊” 。直到 1997年 2月 23日才公布于眾。 通常所說的動物克隆指 體細胞克隆 ，即動物的無性繁殖。 基因疫苗 指的是 DNA疫苗，即將編碼外源性抗原的基因插入載體，然后導入人或動物體內，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，誘導機體產生免疫應答。 164 一、基因診斷的基本方法 ?DNA 分子雜交 ?限制性內切酶酶譜分析 ?限制性片段長度多態(tài)性的連鎖分析 ?PCR方法 ?寡核苷酸探針法 165 （二）基因芯片 基因芯片簡介 基因芯片的種類 ?診斷芯片 ?檢測芯片 ?表達譜基因芯片 3基因芯片的應用 166 生物芯片 1 167 生物芯片 2 。 目的基因不與宿主細胞基因組發(fā)生整合，暫時表達產物發(fā)揮治療作用的基因治療方法叫做基因療法 (gene therapeutics)。 保存物種多樣性和瀕臨滅絕的動物 生產醫(yī)用器官、動物生物反應器 轉基因與動物克隆技術相結合，可降低生產成本。 核移植是指利用顯微外科手術的方法將胚胎細胞或成體細胞的細胞核移人去核的卵母細胞中，構建成重組胚，通過體內或體外培養(yǎng)、胚胎移植，產生與供體細胞基因型相同的后代的技術過程，又稱為動物克隆技術?？茖W家共培育 277個胚胎，只有多莉成功出生。 156 多莉的生命歷程 1998年 4月與威爾士山羊戴維產下邦尼，證明了克隆動物也能生育。 加拿大占６％，達３５０萬公頃。據預測， 2022年世界上動物乳腺生物反應器的年產值將達到 500億美元以上。可以通過家畜乳腺分泌大量安全、高效、廉價的人體藥用蛋白。 149 研究基因的結構與功能，了解動物生命現象的內在本質。然后將帶轉基因體細胞移植到去掉細胞核的卵細胞中，生產重構胚胎。 2）轉基因技術就是指利用分子生物學技術，將某些生物的基因轉移到其它物種中，改造生物的遺傳物質，使遺傳物質得到改造的生物在性狀、營養(yǎng)和消費品質等方面向人類需要的目標轉變。轉基因鼠比與它同胎所生的小鼠生長速度快 2～ 3倍，體積大一倍。 * 與 DNA、 RNA水平上的 Southern雜交、Northern雜交相對應，稱為 Western雜交。 * 因與 DNA的雜交（ Southern 雜交）相對應，故被趣稱為 Northern雜交。 （二）插入失活選擇法 在載體上本來有一個正常表達的基因，在這一基因中間有些多科隆位點，在沒有外源DNA插入時該基因可正確表達，當外源 DNA插入到基因這個中間時，該基因就不能正確表達，這種現象稱為插入失活。 133 他們認為，這是朝著有目的地植入基因以改變動物特性及培養(yǎng)適用于人體的移植器官的重要一步。普法伊費爾與?？斯? 基因導入的方法多種多樣 ， 可根據具體要求進行選擇 ， 具體操作也參考有關實驗手冊 。 原理 ：細胞膜 (其基本組成為磷脂 )， 在適當的外加脈沖電場作用下 ， 細胞膜由于電位差太大而呈現不穩(wěn)定狀態(tài) ， 從而產生孔隙使高分子 （ 如 ATP） 和低分子物質得以進入細胞質內 ， 但還不至于使細胞受到致命傷害 ， 當移動外加電場后 ， 被擊穿的膜孔可自行復原 。 128 5. 顯微注射法 利用 哺乳動物細胞 便于注射的特性 ， 將外源 DNA分子通過顯微注射法直接注入細胞 。 127 4. 原生質體融合法 將帶重組質粒的細菌原生質體同受體細胞進行短暫的共培養(yǎng) ， 經過細胞膜融合 ， 將重組 DNA導入細胞 。 125 3. 多聚物介導法 原理 ：多聚物同二價陽離子 (如 Mg2+,Ca2+,Mn2+等 )和 DNA混合 ， 可在原生質體表面形成顆粒沉淀 ，使 DNA進入細胞內 。 優(yōu)點：定向性好，效率高，重復性好 缺點：載體的侵染范圍有限，對一些經濟性狀（載體較大）的基因轉移比較困難。 一 般 是 將 作 為 受 體 細 胞 的 細 菌 放 在 一 定 濃 度 的 冰 冷CaCl2(50～ 100mmol/l)溶液中處理后 ， 制成 感受態(tài)細胞 ，然后至于 42℃ 高溫熱激 90s的方法幫助其吸收外源 DNA。 3)根據確定的受體細胞 ， 選用相應的克隆載體 ，因為不同生物類型的受體細胞有各自適用的克隆載體 。 （ 3） 動物細胞表達系統(tǒng) 哺乳動物細胞主要是胚胎細胞和培養(yǎng)的體細胞 ， 但培養(yǎng)條件苛刻 ， 成本較高 ， 且易污染 。 （四）同聚物加尾連接 利用末端轉移酶在 DNA 片段的 3‘末端添加同聚物造成延伸部分。