【正文】 選擇標記 用于鑒別目標 DNA （載體）的存在，將成功轉化了載體的宿主挑選出來。它是指在自然條件下，很多質?？梢酝ㄟ^稱為細菌接合的作用轉移到新宿主內。在大腸桿菌中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn) 30 多個不相容群，如 ColE1 和 pMB1 ， pSC101 和 p15A。兩個不相容性質粒在同一個細胞中復制時，在分配到子細胞的過程中會競爭，隨機挑選，微小的差異最終被放大，從而導致在子細胞中只含有其中一種質粒。 2．質粒的拷貝數(shù) 46 47 3．質粒的不相容性 兩個質粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質粒的 不相容性 ，它是指在第二個質粒導入后，在不涉及 DNA 限制系統(tǒng)時出現(xiàn)的現(xiàn)象。 松馳型質粒 : 復制不需要質粒編碼的功能蛋白，其復制完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶 (如DNA聚合酶 Ⅰ 、 Ⅲ ，依賴于 DNA和 RNA聚合酶等 )來進行。 45 質?？截悢?shù)分為嚴謹型與松馳型。質粒的復制和遺傳獨立于染色體，但其復制和轉錄依賴于宿主所編碼的蛋白質和酶。 由質粒 DNA編碼的基因還包括有產(chǎn)生抗菌素的基因、 芳香族化合物降解基因 、 糖酵解基因 、 重金屬抗性基因 、 產(chǎn)生細菌素的基因等等 。 43 從分子量大小看 , 質粒 DNA只占細胞染色體組的一小部分 ， 一般約為 13%， 但卻編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀 。 質粒廣泛存在于細菌之中，在某些藍藻、綠藻和真菌細胞中也存在質粒。 一、基因工程 載體的概念： 41 二、基因工程載體的分類： 基因工程載體決定了外源基因的復制、擴增、傳代乃至表達。 核糖核酸酶 A 商品制劑可能會污染其它酶（如 DNA 酶），使用前應加熱使 DNA 酶失活。可除去 DNA:RNA 中未雜交的 RNA 區(qū)，可用來確定 DNA 或 RNA 中單堿基突變的位置。在 Mn 2+ 存在下，它可在兩條鏈的大致同一位置切割 dsDNA ，產(chǎn)生平端或 12 個核苷酸突出的 DNA 片段。 38 （ 3）脫氧核糖核酸酶 Ⅰ （ DNase Ⅰ ） DNase Ⅰ 來源于牛胰，是內切核酸酶，可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈 DNA 。酶濃度大時可完全消化雙鏈，中等濃度可在切口或小缺口處切割雙鏈。產(chǎn)生帶 539。對于所形成的單鏈突出，可用 DNA 聚合酶補平。 外切核酸酶活性，可從線性 DNA 兩條鏈的 339。 2)在用 ［ r32P］ ATP標記 或 RNA的 5’磷酸前 ， 去除 或片段的非標記 5’磷酸 。 在基因工程中主要用于： 1) 標記 DNA片段的 5’ 端 ， 制備雜交探針 ， 2) 基因化學合成中 ， 寡核苷酸片段 5‘ 磷酸化 ， 3) 用于測序引物的 5‘ 磷酸標記 。 它催化 DNA 5’－磷酸基與 3’－羥基之間形成磷酸二酯鍵 。 注意： DNA連接酶 不能連接兩條單鏈的 DNA分子或環(huán)化單鏈的 DNA分子 ， 被連接的 DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分 。 末端。 逆轉錄酶在基因工程中的主要用途是以真核mRNA為模板 ， 合成 cDNA， 用以組建 cDNA文庫 ， 進而分離為特定蛋白質編碼的基因 。 28 （五）逆轉錄酶 逆轉錄酶是一種有效地轉錄 RNA產(chǎn)生 cDNA的酶 。 27 （三） T4 噬菌體 DNA 聚合酶 T4 噬菌體 DNA 聚合酶來源于 T4 噬菌體感染的 ，分子量 114kDa 。 ⑦ 應用于 PCR 反應，現(xiàn)在已經(jīng)被 Taq DNA 聚合酶等取代。 ⑤ 隨機引物標記。 ③ 通過置換反應對 DNA 進行末端標記。外切活性，使用范圍進一步擴大 26 Klenow DNA 聚合酶用途 ① 補平 3’ 凹端 DNA 。 25 （二） Klenow DNA 聚合酶 ?無 5’→ 3’外切活性 ?有聚合活性 ?有 3’→ 5’外切活性 ?由于沒有 539。但由于具有 5‘3’ 外切活性，現(xiàn)在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反轉錄酶（詳見后面）。 24 2． DNA 聚合酶 Ⅰ 的用途 ① 利用 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 5‘3’ 外切核酸酶活性，可用切口平移法（ nick translation ）標記 DNA ，所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反應。539。 ② 5‘3’ 外切核酸酶活性。 的識別序列 22 二、 DNA聚合酶 （ 一） DNA聚合酶 (DNA Polymerase)的基本特性 能夠將脫氧核糖核苷酸連續(xù)地加到雙鏈 分子引物鏈的 末端催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生引物從膜版上的解離作用。 （ 3） 具有特定的酶切位點 ， 即限制性內切酶在其識別序列的特定位點對雙鏈 DNA進行切割 ， 由此產(chǎn)生特定的酶切末端 。 15 （二）限制性內切酶 命名規(guī)則 限制酶的命名從其來源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個字母 (大寫 )與種名的第一、二兩個字母 (小寫 )組成酶的基本命名，若酶的產(chǎn)生菌由株系之分，則有 4個或 4個以上拉丁字母組成，其第四個字母之后表示株系。 1 第十一章 動物基因工程 2 第一節(jié) 基因工程概述 理論上的三大發(fā)現(xiàn) ?DNA為遺傳物質： Avery的肺炎雙球菌轉化實驗 ?DNA雙螺旋結構的發(fā)現(xiàn)和 DNA半保留復制機制 ?遺傳密碼與中心法則 3 技術上的三大發(fā)明 ： DNA的“手術刀”與“縫紉機” ：運送遺傳物質的工具，如質粒、病毒等 ：從 mRNA到 DNA，使真核基因制備成為可能 4 5 6 7 8 9 10 11 12 基因工程的內容 ?目的基因的獲得 ?目的基因與載體的連接成重組DNA分子 ?重組 DNA分子導入受體細胞 ?篩選重組克隆 ?基因表達與產(chǎn)物分離 13 基因操作中的工具酶 手術刀 －限制性核酸內切酶、核酸外切酶 縫紉機 －連接酶 復印機 － DNA聚合酶、逆轉錄酶 第二節(jié) 基因操作中的工具酶 14 一、限制性內切酶的概述 （一） 概念 限制性核酸內切酶簡稱限制性內切酶，是一類能識別雙鏈 DNA中特定核苷酸序列并具有專一切割位點的脫氧核糖核酸水解酶。 主要存在于細菌、霉菌中，至今已分離到 1000種以上，搞清識別序列的有 300種以上。 如 EcoRI來源于 RY13 BamHI來源于 16 H in d II Haemophilus(屬名 ) Influenzae(種名 ) d(株系 ) 羅馬數(shù)字 限制性內切酶命名舉例 17 類別 反應必須因子 專一性 活性 I型 S腺苷基蛋氨酸，ATP， Mg2+ 識別部位和切點不同， 無特定切割位點 內切 甲基化 II型 Mg2+ 切斷識別部位或其附近的特定部位 只有限制酶活性 III型 ATP， Mg2+ 識別部位和切點不同，但切斷特定部位 內切 甲基化 （三）限制性內切酶分類 18 19 （四） II 型限制性內切酶的特性 （ 1） II型限制酶的識別特異性 ? 回文識別序列 II型限制酶的識別序列大多是具有 雙重對稱結構性結構 ,或稱 回文序列 (Palindromic Sequence) 20 （ 2） 識別特定的核苷酸序列 ， 其長度一般為 4－ 8個核苷酸且呈二重對稱 。 21 識別序列 (位點 ) ?雙鏈 DNA分子上能識別的特定核苷酸序列 ?被識別的堿基序列通常具有雙軸對稱性，即回文序列(Palindromic Sequence)。 ＋ ， ， ， ， ＋ 聚合酶 23 大腸桿菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 1． DNA 聚合酶 Ⅰ 的活性 ① 5‘3’ DNA 聚合酶活性。 ③ 339。 外切酶活性。 ② 用于 cDNA 克隆中的第二鏈，即單純的 DNA 聚合活性。 ③ 對 3‘ 突出端的 DNA 作末端標記（交換或置換反應），但是此反應用 T4 或 T7 DNA 聚合酶效果會更好 。339。 ② 抹平 DNA 3’凸端。 ④ 在 cDNA 克隆中合成第二鏈。 ⑥ 應用于 Sanger 雙脫氧鏈末端終止法的 DNA 測序。 ⑧ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈 DNA 。 T4 噬菌體 DNA 聚合酶與 Klenow 酶相似，但 3‘5’ 外切活性強 200 倍，且不從單鏈 DNA 模板上替換引物，因此在誘變反應中更有用，誘變率約提高 1 倍。產(chǎn)物 DNA 稱 cDNA ， 即 互 補 DNA (plementary DNA)， 該酶又稱為依賴于RNA的 DNA聚合酶 (RNAdependent DNA polymerase)。 29 （六）末端轉移酶 ?來源于小牛胸腺 ?催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3‘ 羥基端 ?dNTP 為 T 或 C ，二價陽離子首選 CO 2+；為 A 或 G 首選 Mg 2+ ?對 3‘ 羥基突出末端的底物作用效率最高 ?在 cDNA 或載體 3‘ 末端加同聚尾用于克隆 ?用標記的 rNTP、 dNTP 或 ddNTP 來標記 DNA 片段的 339。 30 DNA聚合酶在基因工程中的用途： 1) DNA分子的體外合成 2) 體外突變 3) DNA片段探針的標記 4) DNA的序列分析 5) DNA分子的修復 6) 聚合酶鏈式反應 (PCR)等 31 三、 DNA連接酶與 DNA分子的體外連接 體外 DNA片段的連接方式： （ 1） 用 DNA連接酶連接具有互補粘性末端的 DNA片段 （ 2） 用 T4DNA連接酶將平端的 DNA片段連接起來 （ 3） 先在 DNA片段的末端加上化學合成的銜接物或接頭 ， 使之形成粘性末端之后 ， 再用 DNA連接酶將它們連接起來 。 用于將兩段乃至數(shù)段 DNA片段拼接起來的酶稱為連接酶 。 32 具有 3’OH和 5’P基團的缺口 被 DNA連接酶封閉起來 如果缺失一個或數(shù)個核苷酸的裂口 DNA連接酶則不能將它封閉起來 注意： 連接酶 如果缺失一個或數(shù)個核苷酸的裂口 DNA連接酶則不能將它封閉起來 33 四、 其他酶類 、 多核苷酸酶 T4 多核苷酸酶催化 ATP的 ?磷酸基轉移至 DNA或RNA片段的 5‘未端 。 34 堿性磷酸酶 堿性磷酸酶的功能是去除 或 5＇ 未端的磷酸基 ， 反應可表示為： 堿性磷酸酶 5‘p DNA或 5’p RNA 5’－ HO DNA或 5’－ OH RNA 堿性磷酸酶可用于： 1)去除 片段 5‘磷酸 ， 以防止在重組中的自身環(huán)化 ， 以提高重組效率 。 35 利用堿性磷酸酶 CIP 防止 載體的再環(huán)化 pUC19 SacI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PslI SphI Hind III 對接 DNA 可通過