《基因工程dna誘變》ppt課件(文件)
【正文】 （三）轉(zhuǎn)化子誘變（ transformer轉(zhuǎn)化子誘變也使用了 2個寡核苷酸引物，除了突變引物外，還使用了 1個用來剔除單一酶切位點的引物。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌，線性化的模板 DNA不能復制，只有突變保持環(huán)狀，可以獲得轉(zhuǎn)化子。extensionextension,大腸桿菌體內(nèi)DNA在 Dam甲基化酶催化下完全甲基化，對DpnI外切核酸酶 Ⅲ （ 3’→ 5’外切核酸酶活性）?31核酸酶消化?主要活性為 3’外切核酸酶活性，可從線性 DNA兩條鏈的 3’端去掉單核苷酸；?具有較弱的單鏈內(nèi)切核酸酶活性；?依賴 Ca產(chǎn)生平端或 12個核苷酸突出。2+：獨立作用于每條 DNA鏈，切點隨機Mn31核酸酶 （ 3’→5’ 外切核酸酶活性）?第四節(jié) 嵌套缺失逐步從感興趣的 DNA的一端或兩端刪除多個寡核苷酸，得到一套終末端長短不同的嵌套缺失突變體，這個突變體群體也稱 漸次截短文庫 。DpnIby缺點：?PCR擴增 DNA時會產(chǎn)生一定程度的堿基錯配；?在擴增 DNA的 3’末端加上非預設堿基；?對每套引物和模板， PCR反應的條件都需要優(yōu)化；?標準 PCR不能有效擴增大于 3kb的 DNA片段。將待突變的 DNA片段裝載到克隆載體上，該載體上必須存在 1個單一酶切位點。特點： 可正向選擇突變鏈，使用高保真的 T4DNA聚合酶合成DNA，可以使用雙良 DNA作模板，可進行多輪篩選。vitro（一） Kunkel定點誘變法（又稱 “U”法）（二）位點選擇誘變（ altered M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，只感染雄性大腸桿菌，不裂解大腸桿菌細胞，可形成模糊噬菌斑，其基因組為閉合環(huán)狀 DNA，插入 M13的 DNA可以分別回收到兩種形式： dsDNA和 ssDNA。二、誘變寡核苷酸的設計要求① 與靶 DNA的適當鏈互補，并注意與模板的其他區(qū)域不能錯誤雜交；② 足夠的長度與靶序列特異地結(jié)合， 12個堿基改變的引物要求至少 25個堿基長度；③ 錯配堿基位于中央位置，使每側(cè)有 1015個堿基與模板鏈完全匹配；④ 含有與模板完全雜交的 5’端區(qū)，這樣從上游引物起始的DNA合成不至于取代誘變寡核苷酸引物；⑤ 誘變寡核苷酸引物 3’區(qū)域有 1015個堿基與模板鏈完全匹配，形成足夠穩(wěn)定的雜交分子；⑥ 無回紋、重復或自身互補序列；⑦ 5386bp），當用帶琥珀突變的ssDNA與變性的野生型 DNA片段一起轉(zhuǎn)染細菌時，觀察到 “
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