《基因工程實驗》ppt課件-全文預覽
【正文】 10 buffer H ?l EcoR I U dd H2O ?L 10 ?L 1U: 1單位酶通常定義為，在建議緩沖液及溫度下，在 20 ?L 反應液中反應 1h，使 1 ?g DNA完全消化所需的酶量 . 輕輕混勻 , 4000g離心 10秒 ，置于 37℃ 水浴中酶解 。 加入 200?L新配制的溶液 II, 蓋緊管口 ,快速顛倒離心管 ,以混勻內(nèi)容物 ,冰上放置 3－ 5min。L感受態(tài)細胞懸液中加入 1181。g／ mL）； ：稱取 CaCl2，溶于 70mL雙蒸水中，定容到 100mL，過濾后滅菌； ％甘油： 100ml 含有 15ml甘油，高壓滅菌； 溶液 I: 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA ()， 25mmol/L TrisHCl ()； 溶液 II: , 1%SDS (現(xiàn)配現(xiàn)用 )； 溶液 III: 乙酸鉀溶液 (3M, pH=)( 60mL的 5mol/L KAc, 冰醋酸， H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE緩沖液 : 10mmol/L， TrisHCl, 1mmol/L， EDTA， pH ； 5 TBE緩沖液： －硼酸， mol/L EDTA, pH ； 10 Loading buffer： 1% SDS, %溴酚蘭， 50％的甘油； 無水乙醇； 70％乙醇； 標準分子量片段； 核酸內(nèi)切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解緩沖液 (10 buffer H)； 瓊脂糖； 溴化乙啶（ EB）染色液 (10mg/ml)。直接用低濃度的 EB進行染色，可確定 DNA在膠中的位置。 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素： DNA的純度； DNA的甲基化程度； 酶切消化反應的溫度； DNA的分子結(jié)構(gòu)； 溶液中離子濃度及種類； 緩沖液的 pH值。 根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為Ⅰ 、 Ⅱ 、 III型三大類， Ⅰ 類和 III類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴 ATP的限制性內(nèi)切酶活性。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細胞一般是限制 修飾系統(tǒng)（ RestrictionModification）缺陷的變異株，以防止對導入的
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