【正文】 不同限制酶切位點(diǎn)連接 兩種不同的限制性內(nèi)切酶切割不同的 DNA片段，具有相同類型的粘性末端。 第五節(jié) DNA體外重組與基因轉(zhuǎn)移 115 一、載體與目的基因的連接 *DNA 體外重組所需的材料：載體、目的基因、限制性內(nèi)切酶和連接酶。 合成的 DNA片段可用于連接成一個(gè)長的完整基因，用于擴(kuò)增目的基因 (PCR)、引入突變、作為測序引物，還可用于雜交。 三、基因的人工合成 DNA 的化學(xué)合成 113 DNA 的化學(xué)合成 單鏈 DNA短片段的合成已成為分子生物學(xué)和生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù) 。 103 DNA片斷的部分酶解和全部酶解 一個(gè)完整的基因文庫應(yīng)該包括目的生物體所有的基因組。 102 cDNA文庫： 提取出組織細(xì)胞的全部 mRNA，在體外反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，與適當(dāng)?shù)妮d體常用噬菌體或質(zhì)粒載體連接后轉(zhuǎn)化受體菌，則每個(gè)細(xì)菌含有一段 cDNA，并能繁殖擴(kuò)增，這樣包含著細(xì)胞全部 mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細(xì)胞的 cDNA文庫。 ?3‘端絕對不能互補(bǔ)； ?兩引物具有較好的協(xié)調(diào)性； ?內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)較少； ?加酶切位點(diǎn)是需要注意保護(hù)堿基長度； ?檢測特異性； 98 （七） PCR技術(shù)的應(yīng)用 基因克隆 不對稱 PCR與 DNA序列測定 RTPCR與 RNA分析 基因的體外誘變與突變的檢測 基因組研究 99 RTPCR 100 基因文庫 (Gene library)包括 cDNA文庫(cDNA library)和 基因組文庫 (Genomic library)。熱啟動(dòng)（ hot start）PCR操作方式可較好解決這一問題。539。 92 5． PCR 反應(yīng)液的配制 PCR反應(yīng)體系的配置方式有時(shí)也會(huì)影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用 1kb 用 1 分鐘來保證充足的時(shí)間。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為 72℃ 。539。由于沒有 339。539。339。用人類或哺乳動(dòng)物基因組 DNA 進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，一般使用 1μg DNA , 相當(dāng)于單拷貝基因有 3 105 個(gè)拷貝。 84 3． 引物 在多數(shù)試驗(yàn)中人們習(xí)慣使用的引物濃度為各 1mM ，即 1pmol/ml ， 在 100 μl 反應(yīng)體系中相當(dāng)于 6x1013個(gè)分子。緩沖液中還含有 50mM 的鉀離子。HCl ， pH 為 （室溫），而在延伸溫度（ 72 ℃ ）下，pH 值接近 。 78 2． PCR 擴(kuò)增的步驟 首先將模板 DNA 置于 92℃ 96℃ ，進(jìn)行變性 （ denaturation）處理，使 dsDNA 在高溫下解鏈成為 ssDNA ，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì)；然后 退火 （ annealing） ，將溫度降至 37℃ 72℃ ，使引物與模板的互補(bǔ)區(qū)相結(jié)合；最后，在 72℃ 條件下， DNA 聚合酶將 dNTP 連續(xù)加到引物的 339。待拷貝的 DNA 稱為模板，它可以是雙鏈 DNA 也可是單鏈 DNA，最后擴(kuò)增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。 PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛，可以通過 A/T 克隆、 UDG 克隆等方法介導(dǎo)克隆，還可以通過同源重組、 重疊延伸等方法介導(dǎo)定點(diǎn)誘變。 目的基因： ? 純度很高 ? 片斷大小適于重組操作 第四節(jié) 獲得真核生物目的基因的方法 74 目的基因的獲得方法 ? 分離 ? 化學(xué)合成 75 一、利用 PCR法獲取目的基因 :polymerase chain reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是 80年代發(fā)展起來的新技術(shù)，是通過模擬體內(nèi) DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將 DNA 某個(gè)特殊區(qū)域擴(kuò)增出來的技術(shù)。 73 基因工程的主要目的是通過 優(yōu)良性狀相關(guān)基因 的 重組 ， 獲得具有高度應(yīng)用價(jià)值的 新物種 。 70 λ噬菌體載體的主要類型 ?插入型載體： 外源 DNA克隆到插入型載體分子上 ， 會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失效力 . ? 免疫功能失活 （ inactivation of immunity function) ? 大腸桿菌 ?－半乳糖苷酶失活 （ inactivation of ?galactosidase) ? 替換型載體 載體 DNA分子中有一段可以被替換的 DNA片斷 71 用 λ噬菌體作為克隆載體 72 ?噬菌體 DNA的復(fù)制 （ 1)感染早期，環(huán)形 DNA分子可以按 ?形式從雙向進(jìn)行復(fù)制；感染晚期， 滾動(dòng)復(fù)制。 68 ?噬菌體的cos末端 COS 5’CGGGGCGGCGACTCG3’ 3’GCCCCGCCGCTGAGC5’ 5’CG GGGCGGCGACTCG3’ 3’GCCCCGCCGCTGA GC5’ COS 非必須區(qū) 長臂 (左 ) 短臂 (右 ) ?－噬菌體 ?－噬菌體染色體組 蛋白外殼 DNA ?－噬菌體 COS末端 連接（感染后） 裂解（包裝過程） 69 構(gòu)建 λ噬菌體載體的基本途徑為： ?抹去某種限制性內(nèi)切酶在 λDNA分子上的一些識(shí)別序列 ， 只在非必需區(qū)保留 12個(gè)識(shí)別序列 。 ? λDNA上的 D基因和 E基因?qū)κ删w的包裝起決定性作用 ， 缺任何一種基因都將導(dǎo)致噬菌體不能包裝 。 61 多克隆位點(diǎn) 質(zhì)粒載體 pUC 19 在 pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的系列載體 Lac Z’ 半乳糖苷酶基因，在含 Xgal培養(yǎng)基上呈藍(lán)色，插入外源 DNA，重組子培養(yǎng)呈白色 MSC 區(qū)段 pUC優(yōu)點(diǎn)： ?具有更小的分子量，更高的拷貝數(shù)； ?適用于用組織化學(xué)方法檢測重組子； ?具有多克隆位點(diǎn)MSC區(qū)段，與M13mp8噬菌體相同的克隆區(qū)段 62 （二）其他質(zhì)粒載體 低拷貝數(shù)載體 檢測轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)的載體 表達(dá)載體：是在常規(guī)克隆載體的基礎(chǔ)上衍生而來的，主要增添了強(qiáng)啟動(dòng)子，以及有利于表達(dá)產(chǎn)物分泌、分離或純化的元件 63 噬菌體 噬菌體內(nèi)含雙鏈環(huán)形 、 單鏈環(huán)形 、 雙鏈線形 、 單鏈線形等多種形式 、 大小不一的 DNA， 最常見的是雙鏈線形 DNA, 且感染率高 。 易于自身 DNA的純化及克隆載體的純化 ② 具有兩種抗菌素抗性基因可作轉(zhuǎn)化子的選擇記號(hào) ③ 具有較高的拷貝數(shù) 。 在細(xì)胞中合成的這種酶可以分泌至外周質(zhì)腔，保護(hù)宿主不受這些抗生素的影響。 cat 基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，一個(gè)四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白（每個(gè)亞基 23kDa）。四環(huán)素抗性基因編碼一個(gè)由 399 個(gè)氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。 50 氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標(biāo)記，絕大多數(shù)在大腸桿菌中克隆的質(zhì)粒載體帶有該基因。它是指在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。兩個(gè)不相容性質(zhì)粒在同一個(gè)細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，在分配到子細(xì)胞的過程中會(huì)競爭，隨機(jī)挑選，微小的差異最終被放大，從而導(dǎo)致在子細(xì)胞中只含有其中一種質(zhì)粒。 松馳型質(zhì)粒 : 復(fù)制不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，其復(fù)制完全依賴于宿主提供的半衰期較長的酶 (如DNA聚合酶 Ⅰ 、 Ⅲ ，依賴于 DNA和 RNA聚合酶等 )來進(jìn)行。質(zhì)粒的復(fù)制和遺傳獨(dú)立于染色體，但其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄依賴于宿主所編碼的蛋白質(zhì)和酶。 43 從分子量大小看 , 質(zhì)粒 DNA只占細(xì)胞染色體組的一小部分 ， 一般約為 13%， 但卻編碼著一些重要的非染色體控制的遺傳性狀 。 一、基因工程 載體的概念： 41 二、基因工程載體的分類： 基因工程載體決定了外源基因的復(fù)制、擴(kuò)增、傳代乃至表達(dá)?？沙? DNA:RNA 中未雜交的 RNA 區(qū)，可用來確定 DNA 或 RNA 中單堿基突變的位置。 38 （ 3）脫氧核糖核酸酶 Ⅰ （ DNase Ⅰ ） DNase Ⅰ 來源于牛胰，是內(nèi)切核酸酶，可優(yōu)先從嘧啶核苷酸的位置水解雙鏈或單鏈 DNA 。產(chǎn)生帶 539。 外切核酸酶活性，可從線性 DNA 兩條鏈的 339。 在基因工程中主要用于： 1) 標(biāo)記 DNA片段的 5’ 端 ， 制備雜交探針 ， 2) 基因化學(xué)合成中 ， 寡核苷酸片段 5‘ 磷酸化 ， 3) 用于測序引物的 5‘ 磷酸標(biāo)記 。 注意： DNA連接酶 不能連接兩條單鏈的 DNA分子或環(huán)化單鏈的 DNA分子 ， 被連接的 DNA鏈必須是雙螺旋DNA分子的一部分 。 逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中的主要用途是以真核mRNA為模板 ， 合成 cDNA， 用以組建 cDNA文庫 ， 進(jìn)而分離為特定蛋白質(zhì)編碼的基因 。 27 （三） T4 噬菌體 DNA 聚合酶 T4 噬菌體 DNA 聚合酶來源于 T4 噬菌體感染的 ，分子量 114kDa 。 ⑤ 隨機(jī)引物標(biāo)記。外切活性，使用范圍進(jìn)一步擴(kuò)大 26 Klenow DNA 聚合酶用途 ① 補(bǔ)平 3’ 凹端 DNA 。但由于具有 5‘3’ 外切活性，現(xiàn)在已不再使用，而改用 Klenow 酶和反轉(zhuǎn)錄酶（詳見后面）。539。 的識(shí)別序列 22 二、 DNA聚合酶 （ 一） DNA聚合酶 (DNA Polymerase)的基本特性 能夠?qū)⒚撗鹾颂呛塑账徇B續(xù)地加到雙鏈 分子引物鏈的 末端催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生引物從膜版上的解離作用。 15 （二）限制性內(nèi)切酶 命名規(guī)則 限制酶的命名從其來源微生物的拉丁名中摘取，即由其屬名的第一個(gè)字母 (大寫 )與種名的第一、二兩個(gè)字母 (小寫 )組成酶的基本命名，若酶的產(chǎn)生菌由株系之分，則有 4個(gè)或 4個(gè)以上拉丁字母組成，其第四個(gè)字母之后表示株系。 主要存在于細(xì)菌、霉菌中，至今已分離到 1000種以上，搞清識(shí)別序列的有 300種以上。 21 識(shí)別序列 (位點(diǎn) ) ?雙鏈 DNA分子上能識(shí)別的特定核苷酸序列 ?被識(shí)別的堿基序列通常具有雙軸對稱性，即回文序列(Palindromic Sequence)。 ③ 339。 ② 用于 cDNA 克隆中的第二鏈，即單純的 DNA 聚合活性。339。 ④ 在 cDNA 克隆中合成第二鏈。 ⑧ 在體外誘變中，用于從單鏈模板合成雙鏈 DNA 。產(chǎn)物 DNA 稱 cDNA ， 即 互 補(bǔ) DNA (plementary DNA)， 該酶又稱為依賴于RNA的 DNA聚合酶 (RNAdependent DNA polymerase)。 30 DNA聚合酶在基因工程中的用途： 1) DNA分子的體外合成 2) 體外突變 3) DNA片段探針的標(biāo)記 4) DNA的序列分析 5) DNA分子的修復(fù) 6) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)等 31 三、 DNA連接酶與 DNA分子的體外連接 體外 DNA片段的連接方式： （ 1） 用 DNA連接酶連接具有互補(bǔ)粘性末端的 DNA片段 （ 2） 用 T4DNA連接酶將平端的 DNA片段連接起來 （ 3） 先在 DNA片段的末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭 ， 使之形成粘性末端之后 ， 再用 DNA連接酶將它們連接起來 。 32 具有 3’OH和 5’P基團(tuán)的缺口 被 DNA連接酶封閉起來 如果缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的裂口 DNA連接酶則不能將它封閉起來 注意： 連接酶 如果缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的裂口