【正文】 BV320系列通用型高效表達(dá)載體 （ 1） pBV220 已經(jīng)成功用于表達(dá) IL IL IL IL ILLFNa、 IFNr、 TNF、 GCSF、 GMCSF等多種細(xì)胞因子。 條件：電壓： 300～ 600V 維持時間： 20～ 100ms 溫度： 0℃ 電穿孔技術(shù) 磷酸鈣 — DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù) 此法受 二價金屬離子能促進(jìn)細(xì)胞吸收外源 DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。 基因槍適用于動植物、細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎、細(xì)菌及小型動物的轉(zhuǎn)基因。但是，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方法，就能實現(xiàn)脂質(zhì)體與放線菌細(xì)胞之間的融合，來獲得 基因工程放線菌 。 （ 3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟 分為 2步： （ A）人工脂質(zhì)體的制備 （ B）脂質(zhì)體與宿主細(xì)胞的融合 （ A）人工脂質(zhì)體的制備 在含有 重組 DNA分子的水溶液中 + 磷脂 + 吐溫 80（乳化劑） ↓ 通過激烈攪拌或者超聲波處理，將磷脂分散到水溶液之中 ↓ 再經(jīng)過靜置，磷脂分子群聚形成液晶態(tài)脂質(zhì)雙層薄膜 ↓ 將 DNA包埋在薄膜之中形成 微囊 。 （ 2）廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 任意 DNA片段 ，或者重組的 DNA，經(jīng)過體外包裝成噬菌體顆粒，所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用稱為廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)。 （ 2） E基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)占 78%、 E基因突變，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量頭尾蛋白。 （ 2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件 體外 重組的 DNA，要通過 轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，必須經(jīng)過 蛋白質(zhì)包裝 的環(huán)節(jié)， DNA+噬菌體頭部蛋白 + 噬菌體尾部蛋白 →形成 完整的噬菌體顆粒 ，才具有 感染 能力。 轉(zhuǎn)化過程總結(jié)示意圖 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 （ 1）基本概念 （ 2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件 （ 3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序 （ 4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類 （ 1）基本概念 自然界中，通過噬菌體或者病毒的感染作用，將一個細(xì)胞的遺傳信息傳遞到另一個細(xì)胞的過程，稱為 轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） 。 [5]轉(zhuǎn)化程序 大腸桿菌 E . coli培養(yǎng)至 對數(shù)生長期 ↓ 取 20ml，懸浮于 CaCl2 ↓ 離心，收集沉淀的原生質(zhì)球。 （ 4）人工感受態(tài)細(xì)胞 在基因工程中，宿主細(xì)胞經(jīng)過人工處理，最后成為感受態(tài)細(xì)胞，稱為人工感受態(tài)細(xì)胞。 表達(dá)體系 產(chǎn) 物 產(chǎn)生部位 培養(yǎng)方式 提 純 產(chǎn)物活性 潛在危性 大腸桿菌 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 一般 對原核好 不大 融合蛋白質(zhì) 部分高產(chǎn) 對真核差 酵 母 多肽蛋白質(zhì) 菌體內(nèi) 容易 菌體內(nèi) 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高產(chǎn) 稍復(fù)雜 天然產(chǎn)物 哺乳動物 完 整 外分泌 較難成本高 簡單 可達(dá)天然 需注意 糖基化蛋白 可高產(chǎn) 產(chǎn)物 致癌 主要基因工程表達(dá)體系比較 （二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù) 轉(zhuǎn)化作用 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 轉(zhuǎn)化作用 （ 1）基本概念 （ 2）轉(zhuǎn)化作用的特性 （ 3）感受態(tài)細(xì)胞 （ 4）人工感受態(tài)細(xì)胞 （ 5）轉(zhuǎn)化程序 （ 6）影響轉(zhuǎn)化的因素 （ 1）基本概念 轉(zhuǎn)化 (transformation)： 以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程 . （ 2）轉(zhuǎn)化作用的特性 （ 1）是自然界經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象之一。 ? 優(yōu)點： （ 1）有很強(qiáng)的 蛋白質(zhì)分泌能力 ， （ 2）能正確地進(jìn)行 翻譯后的加工 ，如進(jìn)行 糖基化 、肽剪切。 優(yōu)點： （ 1）是研究基因表達(dá)調(diào)控 最有效 的單細(xì)胞真核生物， （ 2）其基因組小、繁殖迅速、可以利用廉價材料進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)， （ 3）無毒性， （ 4）基因工程操作簡單， （ 5）表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物能夠直接 分泌 出細(xì)胞外， （ 6）能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)產(chǎn)物 進(jìn)行糖基化 ， （ 7）真核基因在酵母中表達(dá)良好。 （ 2）枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的 胞外蛋白酶 分泌系統(tǒng)，常常對蛋白質(zhì)產(chǎn)物造成 破壞 。 至 2022年， FDA共批準(zhǔn)了大腸桿菌表達(dá)的基因重組生物技術(shù)藥物 18種 ： 重組人甲狀旁腺激素、胰島素、生物激素、白介素、干擾素等主要為細(xì)胞因子類藥物。 （ 3）所表達(dá)的真核蛋白質(zhì)在其體內(nèi)常形成 包含體 ，在提取后必須經(jīng)過變性、復(fù)性處理才能恢復(fù)生物活性。 （ 3） 基因工程研究中采用最多的表達(dá)體系。 宿主細(xì)胞的類型 原核細(xì)胞類： 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鏈霉菌。 （ 9） 容易進(jìn)行代謝調(diào)控。 （ 5）發(fā)熱量低。 （一）宿主細(xì)胞的選擇 （二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù) （三）大腸桿菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá) （四）酵母菌中的基因?qū)牒捅磉_(dá) （五）動物細(xì)胞中的基因?qū)牒捅磉_(dá) （一）宿主細(xì)胞的選擇 宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件 宿主細(xì)胞的類型 宿主細(xì)胞應(yīng)滿足的條件 （ 1）容易獲得較高濃度的細(xì)胞。隨著時間的推移而 逐漸失活 。 （ 4） 不產(chǎn)生內(nèi)毒素 。 （ 8）需有適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵濃度。 （ 12） 產(chǎn)物容易提取和純化。 （ 2） 分子遺傳結(jié)構(gòu)清楚、操作簡單 。給提取帶來困難。 （ 6）大腸桿菌會 產(chǎn)生內(nèi)毒素 ，難去除。 缺點： （ 1） 不能使蛋白質(zhì)產(chǎn)物糖基化 。干擾素和乙肝表面抗原基因在酵母菌中進(jìn)行克隆和表達(dá)。 （ 5）絲狀真菌 曲霉被認(rèn)為一