【正文】 物 完 整 外分泌 較難成本高 簡單 可達(dá)天然 需注意 糖基化蛋白 可高產(chǎn) 產(chǎn)物 致癌 主要基因工程表達(dá)體系比較 （二）具體的轉(zhuǎn)移技術(shù) 轉(zhuǎn)化作用 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 轉(zhuǎn)化作用 （ 1）基本概念 （ 2）轉(zhuǎn)化作用的特性 （ 3）感受態(tài)細(xì)胞 （ 4）人工感受態(tài)細(xì)胞 （ 5）轉(zhuǎn)化程序 （ 6）影響轉(zhuǎn)化的因素 （ 1）基本概念 轉(zhuǎn)化 (transformation)： 以質(zhì)粒為載體構(gòu)建的重組DNA分子導(dǎo)入原核細(xì)胞的過程 . （ 2）轉(zhuǎn)化作用的特性 （ 1）是自然界經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象之一。 （ 2）轉(zhuǎn)化作用的 前提條件 是宿主細(xì)胞必須轉(zhuǎn)變?yōu)?感受態(tài)細(xì)胞 。 （ 3）轉(zhuǎn)化作用的先決條件是要獲得攜帶目的基因的重組 DNA分子。 （ 3）感受態(tài)細(xì)胞 感受態(tài) (petent) :指細(xì)胞在一定的生理狀態(tài)可攝取外源性遺傳物質(zhì)經(jīng)體內(nèi)重組成為染色體中的一部分 ,導(dǎo)致受體細(xì)胞某些遺傳性狀的改變。 （ 4）人工感受態(tài)細(xì)胞 在基因工程中，宿主細(xì)胞經(jīng)過人工處理，最后成為感受態(tài)細(xì)胞，稱為人工感受態(tài)細(xì)胞。 所有生物細(xì)胞均可處理成人工感受態(tài)細(xì)胞。 制備人工感受態(tài)細(xì)胞的方法： （ 1）將 對數(shù)生長期細(xì)胞 于低溫、 低滲的 CaCl2溶液中處理，就可成為感受態(tài)細(xì)胞。 （ 2）用 MgCl CsCl、 LiCl、或者是多價陽離子 DETESephadex處理，改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，也能成為感受態(tài)細(xì)胞。 [5]轉(zhuǎn)化程序 大腸桿菌 E . coli培養(yǎng)至 對數(shù)生長期 ↓ 取 20ml，懸浮于 CaCl2 ↓ 離心，收集沉淀的原生質(zhì)球。 ↓ 再懸浮于 CaCl2 ↓ 加入 23ug重組的 DNA，混勻 ↓ 0℃ 放置 30min ↓ 42℃ ， 90s ↓ 冰浴 5min ↓ 離心，收集沉淀的細(xì)胞 ↓ 將細(xì)胞涂于選擇性培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng) ↓ 根據(jù)菌落特性，篩選出 基因工程菌 （ 6）影響轉(zhuǎn)化的因素 重組 DNA轉(zhuǎn)化率很低，在 %左右。影響因素： （ 1）宿主的 限制酶 對外源性重組 DNA的限制作用，會大大降低轉(zhuǎn)化率， （ 2）宿主細(xì)胞的 人工感受態(tài) 形成率，會影響轉(zhuǎn)化率， （ 3）重組 DNA的構(gòu)型 與轉(zhuǎn)化率有一定的關(guān)系，環(huán)狀 DNA的轉(zhuǎn)化率要比 線性 DNA高出 10100倍， （ 4）外源基因與宿主 DNA和同源性越高，其轉(zhuǎn)化率也越高。 （ 5）重組 DNA的 濃度 越高、其轉(zhuǎn)化率也越高，DNA的 純度 越高、其轉(zhuǎn)化率也越高。 轉(zhuǎn)化過程總結(jié)示意圖 轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 （ 1）基本概念 （ 2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件 （ 3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序 （ 4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類 （ 1）基本概念 自然界中，通過噬菌體或者病毒的感染作用，將一個細(xì)胞的遺傳信息傳遞到另一個細(xì)胞的過程，稱為 轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） 。 感受態(tài)細(xì)胞吸收以噬菌體、病毒為載體的重組 DNA的過程稱為 轉(zhuǎn)染 (transfection)。也屬于轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。 自然界許多溫和噬菌體都具有轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。 （ 2）轉(zhuǎn)導(dǎo)條件 體外 重組的 DNA，要通過 轉(zhuǎn)導(dǎo) 途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，必須經(jīng)過 蛋白質(zhì)包裝 的環(huán)節(jié)， DNA+噬菌體頭部蛋白 + 噬菌體尾部蛋白 →形成 完整的噬菌體顆粒 ，才具有 感染 能力。 （ 3）轉(zhuǎn)導(dǎo)程序 [A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序 [B]、轉(zhuǎn)導(dǎo)程序 [A]、蛋白質(zhì)體外包裝程序 蛋白質(zhì)的體外包裝是通過 互補作用 實現(xiàn)的。 λ 噬菌體的 D基因 、 E基因 是 表達(dá)蛋白質(zhì)的主要基因。 （ 1） D基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)占 20%、 D基因突變，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量頭部蛋白。 （ 2） E基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)占 78%、 E基因突變，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生大量頭尾蛋白。 [B]、轉(zhuǎn)導(dǎo)程序 用于制備包裝蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞 cI857大腸桿菌 E . coli、 BHB2690、 BHB2688。 ↓ D基因突變型宿主 BHB2690培養(yǎng)、并且進(jìn)行溶菌處理， 提取 DNAd ++ 外源性目的基因 DNA + + E基因突變型宿主 BHB2688培 養(yǎng)、并且進(jìn)行溶菌處理，提取 DNAe ↓ 溫育 ,包裝成完整的 外源基因 λ 噬菌體重組顆粒 。（具有再感染能力） ↓ 去感染大腸桿菌 E . coli ↓ 完成轉(zhuǎn)導(dǎo) （ 4）轉(zhuǎn)導(dǎo)作用分類 （ 1）限制性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 由 溫和的噬菌體或者病毒 DNA為載體 所構(gòu)成的重組 DNA，經(jīng)過體外包裝，形成完整的噬菌體或者病毒顆粒，所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用稱為 限制性轉(zhuǎn)導(dǎo) 。 （ 2）廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)作用 任意 DNA片段 ，或者重組的 DNA，經(jīng)過體外包裝成噬菌體顆粒，所進(jìn)行的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用稱為廣義性轉(zhuǎn)導(dǎo)。 脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用 （ 1）定義 （ 2）脂質(zhì)體的特性 （ 3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟 （ 4）脂質(zhì)體介導(dǎo)的應(yīng)用 （ 1）定義 將重組的 DNA分子包埋于脂質(zhì)體微囊之中，通過脂質(zhì)體微囊與宿主細(xì)胞的融合作用，而將外源性目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)的過程稱為 脂質(zhì)體介導(dǎo)的融合作用 。 （ 2）脂質(zhì)體的特性 脂質(zhì)體： 人工構(gòu)建的由磷脂雙分子層組成的膜狀 結(jié)構(gòu)。 原理：受體細(xì)胞的細(xì)胞膜表面帶負(fù)電荷，脂質(zhì)體 顆粒帶正電荷，利用引力作用，把 DNA、mRNA及單鏈 RNA等導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi) 主要適用于真核細(xì)胞 ,可對基因進(jìn)行瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。 （ 3）脂質(zhì)體介導(dǎo)融合的步驟 分為