基因工程制藥技術(shù)-文庫吧
2024-12-22 07:10 本頁面
【正文】 酵母表達(dá)系統(tǒng)細(xì)胞：單細(xì)胞真核生物，球形、橢圓形、卵形。繁殖：芽殖、裂殖。在特定條件下才產(chǎn)生子囊孢子。菌落：乳白色，有光澤，邊沿整齊。優(yōu)點(diǎn)：? 安全、無毒。? 營養(yǎng)缺陷選擇外來質(zhì)粒。? 培養(yǎng)條件簡單、大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)成熟。? 亞細(xì)胞器分化，進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯后正確修飾和加工，并具有良好的蛋白質(zhì)分泌能力。缺點(diǎn)：? 釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，制約了高密度發(fā)酵。? 修飾的蛋白質(zhì)糖基化側(cè)鏈過長，會(huì)引起副作用?；蚬こ探湍傅膽?yīng)用? 1981年 Hitzman等：酵母表達(dá)人干擾素l激素類： 6種人胰島素及 1種突變體，尿酸水解酶和水蛭素 ； 細(xì)胞因子： GMCSF和血小板衍生生長因子l多肽類：高血糖素l2種乙肝疫苗等。水蛭素? 水蛭素： 從水蛭唾液中提取 的天然特效凝血酶抑制劑? 天然水蛭素是由 65個(gè)氨基酸組成的多肽化合物，在低于 70攝氏度的環(huán)境溫度下都能保持活性。它溶于水，能夠阻止血液中纖維蛋白的凝固，抑制凝血酶與血小板的結(jié)合，有極強(qiáng)的溶解血栓作用。? 重組水蛭素是用基因工程通過大腸桿菌、噬菌體或酵母菌表達(dá)產(chǎn)生，其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)與天然水蛭素唯一不同的是其 63位酪氨酸殘基未硫酸化，該特點(diǎn)使其對(duì)凝血酶的抑制作用明顯降低，僅為天然水蛭素的 1/10。但這種方法能獲得相當(dāng)量的重組水蛭素，所以極大地推動(dòng)了水蛭素的藥理、臨床等方面研究工作的深人開展。 三 基因工程菌 的 培養(yǎng)與發(fā)酵? （ 1） 培養(yǎng)基組成與控制碳源氮源無機(jī)鹽選擇劑誘導(dǎo)物碳源l大腸桿菌：蛋白胨等蛋白質(zhì)的降解物作為碳源l酵母：利用葡萄糖、半乳糖等單糖類物質(zhì)。l添加低濃度的單糖和雙糖及其他有機(jī)物如甘油等對(duì)菌體生長具有一定的促進(jìn)作用。l濃度稍高后就表現(xiàn)出底物抑制作用。l葡萄糖優(yōu)先利用會(huì)造成培養(yǎng)基的酸化。氮源l直接很好地吸收利用銨鹽等，一般不能利用硝態(tài)氮。幾乎都能利用有機(jī)氮源。l不同工程菌對(duì)氮源利用能力差異很大，具有很高的選擇性。l大腸桿菌：利用大分子有機(jī)氮源，酵母粉等。l酵母：利用氨基酸為氮源無機(jī)鹽l磷、硫、鉀、鈣、鎂、鈉等大量元素和鐵、銅、鋅、錳、鉬等微量元素的鹽離子形態(tài)l基因工程菌生長提供必需的礦物質(zhì)。選擇劑 selective agentl維持工程菌的純正性和質(zhì)粒的穩(wěn)定性的化合物。l發(fā)酵培養(yǎng)過程中質(zhì)粒容易丟失，使之成為宿主菌為了保證質(zhì)粒的穩(wěn)定性，不丟失 ， 根據(jù)質(zhì)粒上的營養(yǎng)缺陷或選擇性標(biāo)記基因，添加或缺陷選擇劑。誘導(dǎo)物? 誘導(dǎo)表達(dá)型工程菌：在細(xì)胞生長到一定階段，必需添加誘導(dǎo)物，以解除目標(biāo)基因的抑制狀態(tài)，活化基因，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，生成產(chǎn)物。? 誘導(dǎo)物成為產(chǎn)物表達(dá)必不可少的。? Lac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)： IPTG誘導(dǎo)。? 甲基營養(yǎng)型酵母：加入甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)l溫度l溶解氧lpH大腸桿菌和釀酒酵母生長最低溫度為 10℃大腸桿菌生長最適溫度為 37℃ ，最高溫度為 45℃ 。釀酒酵母生長最適溫度為 30℃ ，最高溫度為 40℃ 。溫度對(duì)工程菌發(fā)酵的影響兩段變溫發(fā)酵培養(yǎng)：前期：較高溫度發(fā)酵，獲得足夠高的菌體密度；后期：較低溫培養(yǎng)發(fā)酵，對(duì)菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物的抑制不明顯，但可有效抑制目標(biāo)產(chǎn)物的降解和包涵體形成，總體提高工程菌的生產(chǎn)能力。溫度誘導(dǎo)型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)：生長期維持 37℃，生產(chǎn)期提高溫度 42℃ 。溫度控制pH值對(duì)發(fā)酵的影響細(xì)菌喜歡偏堿性：大腸桿菌適宜 pH為 ～ ，真菌喜歡微酸性：酵母適宜 pH為 ～ 。影響產(chǎn)物穩(wěn)定性，最適生長和最適生產(chǎn) pH不同。干擾素是在酸性條件下穩(wěn)定，而在堿性條件下容易降解。酸性環(huán)境有利于發(fā)揮菌株生產(chǎn)能力。乙酸 的產(chǎn)生使菌體生長速率下降，也抑制基因表達(dá)。pH值控制了解發(fā)酵過程中各個(gè)階段的適宜 pH以后，需要進(jìn)一步設(shè)法控制 pH在合適的范圍內(nèi)。分階段控制 pH： 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果 來確定生長最適 pH和產(chǎn)物最適 pH，以達(dá)到最佳生產(chǎn)。溶解氧控制工程菌是好氧微生物，生長過程需要大量氧。從供應(yīng)量和需要量（菌體生長、質(zhì)粒穩(wěn)定性、產(chǎn)物積累）二個(gè)方面考慮，使之需氧不超過設(shè)備的供氧能力考慮溶氧對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響：調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量四 重組人干擾素生產(chǎn)工藝l 概念：（ interferon， IFN）? 機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的細(xì)胞因子l 功能：干擾病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖l 天然干擾素分類：? ?? I干擾素： IFNα、 IFNβ、 IFNτ、 IFNε、 IFNω? ?? II干擾素： IFNγl 上市重組干擾素 :α2a、 α2b、 α1b、 β1b， γl 研發(fā)中的重組干擾素： IFNω，臨床階段l廣譜抗病毒活性（ rhuIFNα ） 慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。l直接抗腫瘤活性（ rhuIFNα ）?? 毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、 Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。l免疫調(diào)節(jié)活性 —— 治療慢性肉芽腫瘤（ rhuIFNγ ）l多發(fā)性硬化癥 rhuIFNβ重組干擾素的臨床應(yīng)用l體外誘生干擾素制備工藝： Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞干擾素生產(chǎn)工藝路線（ 1）l1989年： IFNαn3/Alferon，批準(zhǔn)上市l(wèi)產(chǎn)量低： 1gIFNα，需要 3億 ml人血白細(xì)胞l來源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴l潛在的血源性病毒污染的可能性l人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝： 干擾素生產(chǎn)工藝路線（ 2）l1999年： IFNαn1/Wellferon,批準(zhǔn)用于臨床。l優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)
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