【正文】 素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素指示液（ I2KIAampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長，但不殺死細(xì)菌。殺死生長的細(xì)菌，但不殺死停止生長的細(xì)菌。（ 3）環(huán)絲氨酸如果在 Tetr上插入外源 DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用 四環(huán)素加環(huán)絲氨酸 平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨酸殺死，保留下來；Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（ 1）四環(huán)素抗性插入失活無環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基（ 2）氨芐青霉素抗性插入失活選擇過程如果 Ampr上插入外源 DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘 青霉素指示液選擇。2.pUC質(zhì)粒載體1987年， 用 MCS技術(shù)在 pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的。結(jié)構(gòu)：（ 1）來自于 pBR322的 Ori（ 2）氨芐青霉素的抗性基因(Ampr)。（ 3） LacZ′基因 編碼 β— 半乳糖酶的 α— 肽鏈即氨基末端。（ 4） MCS區(qū)段是一段用于插入外源 DNA片段的特定區(qū)域，由一系列的緊密相連的限制性內(nèi)切酶位點組成，而且每個限制性內(nèi)切酶位點在整個載體中是唯一的。pUC18 / 19： 與 pBR322相比， pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點：（ 1）具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)如 pUC8為 2750bp， pUCl8為 2686bp， 控制質(zhì)粒復(fù)制rop基因的缺失，平均每個細(xì)胞即可達(dá) 500～ 700個拷貝（ 2）適用于組織化學(xué)法檢測重組體通過 ?互補 作用，利用菌落顏色篩選重組子。（ 3）具有多克隆位點區(qū)段（ MCS）可以定向克隆防止載體自我連接。?互補 (alphaplementation)大腸桿菌 ?半乳糖苷酶 可以和其底物 XGal相互作用并且釋放出一種藍(lán)色物質(zhì)，當(dāng)該酶的 ?片段 和 ?片段 分開時就失去了這種顯色的功能。通常將編碼該酶 ?片段 的 LacZ’基因插入到載體的多克隆位點的側(cè)翼序列中，而在一些人工構(gòu)建的大腸桿菌株系中卻只能編碼產(chǎn)生該酶的 ?片段 。這樣一來，含有功能性完整的 LacZ’ 基因的載體導(dǎo)入到這類寄主細(xì)胞中時，載體編碼的 ?片段 就能和寄主編碼的 ?片段 發(fā)生互補并具有了對底物 Xgal的作用功能（發(fā)生顯色反應(yīng)），這種現(xiàn)象被成為是 alphaplementation.XGal： 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷 釋放出的藍(lán)色物質(zhì)可以將整個菌落染成藍(lán)色，非常容易辨別，如果 LacZ’插入外源基因被破壞，菌落則是無色的 ,這種篩選稱為 藍(lán)白斑篩選 。組織化學(xué)法檢測重組體XGal?半乳糖苷酶IPTG誘導(dǎo)物異丙基 βD硫代半乳糖苷 半乳糖 5溴 4氯 靛藍(lán)＋a互補顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選）lacZβ半乳糖苷酶 分解乳糖i P O調(diào)控蛋白 Pα肽段分解 Xgal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍(lán)色誘導(dǎo)劑 IPTGβ半乳糖苷酶基因 lacZ突變體 M15重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19：正選擇標(biāo)記 lacZ’ 的顯色原理pUC18/19PlaclacZ’MCS?半乳糖苷酶的 ?肽段??5溴 4氯 3吲哚 ?D半乳糖苷Xgal167。 藍(lán)白斑篩選 ：利用 β半乳糖苷酶插入失活的載體，在生色底物 (Xgal)和誘導(dǎo)物 IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）存在時，可形成深藍(lán)色菌斑。用這種載體進(jìn)行克隆時， β半乳糖苷酶基因的被外源 DNA片段插入，所產(chǎn)生的重組體喪失 α互補能力，在含有 Xgal和 IPTG的平板下形成無色菌斑。因此，對于這類重組載體，可通過組織化學(xué)方法進(jìn)行重組子的篩選。藍(lán)斑 白斑?半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使 Xgal分解成蘭色產(chǎn)物。3.pGEM3Z216。多拷貝216。裝有兩個噬菌體的強啟動子 用于外源基因的高效表達(dá) 216。裝有多克隆位點（ MCS）216。選擇標(biāo)記基因 Apr lacZ’注意： T7和 SP6啟動子特異性地由噬菌體 DNA編碼的RNA聚合酶所識別，因此相應(yīng)的受體菌必須表達(dá)噬菌體 RNA聚合酶，如： BL21（ DE3）等2743 bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM3E PSP6 l噬菌體載體n 噬菌體 (bacteriophage,phage)：是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。v 根據(jù)噬菌體與宿主菌的相互關(guān)系，噬菌體可分為兩類 —— 毒性噬菌體 /烈性噬菌體 (virulentphage)： 能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，產(chǎn)生許多子代噬菌體，并最終裂解細(xì)菌。v 溫和噬菌體 (temperatephage)： 噬菌體基因與宿主染色體整合，不產(chǎn)生子代噬菌體，但噬菌體DNA能隨細(xì)菌 DNA復(fù)制，并隨細(xì)菌的分裂而傳代。252。 溫和噬菌體的基因組能與宿主菌基因組整合，并隨細(xì)菌分裂傳至子代細(xì)菌的基因組中，不引起細(xì)菌裂解。整合在細(xì)菌基因組中的噬菌體基因組稱為 前噬菌體 (prophage)， 帶有前噬菌體基因組的細(xì)菌稱為 溶原性細(xì)菌 (lysogenicbacterium).噬菌體侵染大腸桿菌毒性噬菌體的復(fù)制周期 — 溶菌性周期n 在液體培養(yǎng)基中，噬菌現(xiàn)象可使渾濁菌液變得澄清。n 在固體培養(yǎng)基上，若用適量的噬菌體和宿主菌液混合后接種培養(yǎng)，培養(yǎng)基表面可有透亮的溶菌空斑出現(xiàn)。一個空斑系由一個噬菌體復(fù)制增殖并裂解細(xì)菌后形成，稱為 噬菌斑 (plaque),不同噬菌體噬斑的形態(tài)與大小不盡相同。噬菌斑 l噬菌體克隆載體 噬菌體的 DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：高效率的感染性能使外源基因高效導(dǎo)入受體細(xì)胞自主復(fù)制繁殖性能使外源基因在受體細(xì)胞中高效擴(kuò)增大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA噬菌體的生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)l噬菌體是 大腸桿菌的 溫和型噬菌體l噬菌體 由外殼包裝蛋白和 lDNA組成 lDNA全長 48502個核苷酸lDNA上 至少有 61個基因l 噬菌體生物學(xué)特性： 生物結(jié)構(gòu)5’ TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA 5’ COSCOScos 頭部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制 基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重組基因刪除與整合基因l DNAn cos區(qū)： 在 l噬菌體線性雙鏈 DNA的左右兩端，各有一個由 12nt組成的彼此完全互補的 5‘單鏈突出單鏈序列（黏性末端），分別為 5’–TCCAGCGGCGGGG3‘， 3’CCCGCCGCTGGA5’， 包裝蛋白的識別位點。大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建： 縮短長度 野生型 lDNA包裝的上限為 51kb，本身長度為 ，只有當(dāng)插入的外源 DNA片段不大于 ，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型 lDNA的長度，可以提高裝載量。其實野生型 lDNA上約有4050%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將 lDNA分成兩大類載體： 插入型載體： 只具有一個可供外源 DNA插入的克隆位點置換型載體： 具有成對的克隆位點 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建：插入型載體體外包裝插入位點體外包裝插入片段lgt載體長度 43340 bp插入片段大?。? 14 kb大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建：置換型載體體外包裝體外包裝插入片段最小裝載長度 10 kb載體長度 43 kb插入片段最大裝載長度 25 kbn 特殊性質(zhì)：n l DNA的長度 大于 野生型 l 噬菌體 DNA長度的75%而不超過其 105%時，才能被包裝成噬菌體顆粒，當(dāng) DNA的長度短于野生型的 75%而或超過其105%時，噬菌體的活性就急劇下降， 因此要求 l 載體 DNA和外源 DNA長度之和在 ~51kb之間。大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建： 刪除重復(fù)的酶切位點野生型的 lDNA鏈上有 5個 EcoRI位點和 7個 HindIII位點，不利于重組操作，必須刪除至 1 2個同時，為了便于各種來源的 DNA片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點。除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術(shù)去除或增添酶位點。大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記與質(zhì)粒不同，野生型 lDNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此加裝 選擇標(biāo)記是 lDNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容。 lDNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類：免疫功能類標(biāo)記顏色反應(yīng)類標(biāo)記大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記 imm434imm434基因編碼一種阻止 l噬菌體進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記基因的 l載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源 DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， l重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。大腸桿菌的 l 噬菌體 DNAlDNA載體的構(gòu)建：加裝選擇標(biāo)記 lacZ’lacZ’基因編碼 ?半乳糖苷酶，能催化無色的 Xgal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到 lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍(lán)色化合物；而空載體 lDNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。n DNA+蛋白外殼n Cos位點：包裝蛋白的識別位點n 包裝 DNA的大?。阂吧停?）的 75% 或超過 105% ，要求 l載體 DNA和外源 DNA長度之后在 ~51kb之間。其 DNA中約有 20kb是非必需區(qū)段。l DNA重組分子的體外包裝lDNA重組分子的體外包裝llDNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞。l用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了 l噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。 這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩