基因工程3大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)-展示頁(yè)
2025-06-04 06:00本頁(yè)面
【正文】 常用的大腸桿菌表達(dá)載體 迄今為止，基因工程學(xué)家已經(jīng)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一系列的以原核啟動(dòng)子取代真核啟動(dòng)子的質(zhì)粒表達(dá)載體系統(tǒng)。因此，在構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體時(shí)，通常安臵上全部的三個(gè)終止密碼子，以便阻止發(fā)生核糖體的“跳躍”現(xiàn)象。 分子機(jī)制不明。這類特殊序列元件特稱為 翻譯增強(qiáng)子 。 例如 : 在 RBS序列中增加 AT含量； 誘發(fā)特異堿基發(fā)生定點(diǎn)突變； 以及使用翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)進(jìn)行克隆基因的表達(dá)。 （ 3）翻譯起始序列 mRNA轉(zhuǎn)錄本 5’端的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征（核糖體結(jié)合位點(diǎn)， RBS），是決定 mRNA翻譯效率的主要因素。 —啟動(dòng)子封堵作用 * 在克隆基因編碼區(qū)的 3’末端接上一個(gè)有效的轉(zhuǎn)錄終止子，便能夠阻止轉(zhuǎn)錄通讀。 3）這種啟動(dòng)子應(yīng)是誘導(dǎo)型的，能通過(guò)簡(jiǎn)單的方式使用廉價(jià)的誘導(dǎo)物而得以誘導(dǎo)，如物理（如熱）和化學(xué)（如 IPTG）誘導(dǎo) 。 2）這個(gè)啟動(dòng)子應(yīng)能呈現(xiàn)一種低限的基礎(chǔ)表達(dá)水平。 重要條件 ： 編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物應(yīng)能維持正常的穩(wěn)定性。 克隆基因正確表達(dá)的基本條件 最基本條件 ：應(yīng)該能夠進(jìn)行正常的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯，以及在正常情況下還與轉(zhuǎn)譯后加工及新生多肽在細(xì)胞中的分布有關(guān)。 4. 許多真核基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，都要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)譯后的加工修飾（正確折疊和組裝），而大多數(shù)的這類修飾作用在細(xì)菌細(xì)胞中并不存在； 5. 細(xì)菌的蛋白酶，能夠識(shí)別外來(lái)的真核基因所表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，并把它們降解掉。 細(xì)菌的 RNA聚合酶不能識(shí)別真核的啟動(dòng)子；外源基因可能含有具大腸桿菌轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能的核苷酸序列。 大腸桿菌中表達(dá)體系的不足 ： 1. 真核基因，在結(jié)構(gòu)上同原核基因之間存在著很大的差別。但比較而言，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)越性。 宿主細(xì)胞分為兩大類： 原核細(xì)胞：常用有大腸桿菌、枯草芽胞桿菌、 鏈霉菌等； 真核細(xì)胞：常用有酵母、絲狀真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。 ⑷ 表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化。 ⑵ 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定 。 ?基因高效表達(dá)研究是指外源基因在某種細(xì)胞中的表達(dá)活動(dòng)，即剪切下外源基因片段，拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中，使其能獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物。前言 ?基因表達(dá)是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過(guò)程。 ?基因工程主要目標(biāo)之一是生產(chǎn)常規(guī)方法難以生產(chǎn)的大量蛋白質(zhì)產(chǎn)物 — 即實(shí)現(xiàn)基因的高效表達(dá)。 第三章 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá) 最佳的基因表達(dá)體系： ⑴目的基因的表達(dá)產(chǎn)量高 。 ⑶ 生物活性高 。 第一節(jié)基因的表達(dá)系統(tǒng)與表達(dá)策略 宿主細(xì)胞的選擇 適合目的基因表達(dá)的宿主細(xì)胞的要求 : 容易獲得較高濃度的細(xì)胞； 能利用易得廉價(jià)原料； 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 發(fā)熱量低、需氧低、適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)； 容易進(jìn)行代謝調(diào)控； 容易進(jìn)行 DNA重組技術(shù)操作； 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高， 產(chǎn)物容易提取純化。 一、真核基因的大腸桿菌表達(dá)體系 目前，已被用于表達(dá)外源蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌（大腸桿菌和枯草桿菌）、酵母、昆蟲(chóng)、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。 大腸桿菌表達(dá)體系的優(yōu)越性 ： 1. 對(duì)大腸桿菌的背景知識(shí)（完成基因組全測(cè)序哦），特別是基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)理有（乳糖操縱子）深刻的了解； 2. 是一種安全的基因工程實(shí)驗(yàn)體系，擁有各類適用的寄主菌株和不同類型的載體； 3. 許多克隆的真核基因都可以在大腸桿菌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)有效、高水平的表達(dá)； 4. 大腸桿菌培養(yǎng)方便、操作簡(jiǎn)單、成本低廉，易用于批量生產(chǎn)。 2. 真核基因的轉(zhuǎn)錄信號(hào)同原核的不同。 3. 真核基因 mRNA的分子結(jié)構(gòu)同細(xì)菌的有所差異，影響真核基因 mRNA穩(wěn)定性。 6. 大腸桿菌周質(zhì)內(nèi)存在各種內(nèi)毒素。 啟動(dòng)子 、 終止子 以及正確 讀碼框（ ORF） 。 具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)； 具有強(qiáng)啟動(dòng)子； …… 二、大腸桿菌的表達(dá)載體 大腸桿菌表達(dá)載體的基本成分 TTGACA。 TATAAT 35 17 10 P R TAAGGAGG（ N） 8 ATG（ 91%） GTG（ 8%） TTG（ 1%） 編碼序列 TAA TGA TAG TT tetr Ori RBS 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 ? 啟動(dòng)子 ? 終止子 ? 核糖體結(jié)合位點(diǎn) ? 密碼子 ? 質(zhì)?？截悢?shù) 轉(zhuǎn)錄水平 翻譯水平 （ 1）啟動(dòng)子 要使克隆的外源基因高水平表達(dá)的最佳啟動(dòng)子，必須具備以下幾個(gè)條
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