【正文】 子； SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成 ； 基因編碼區(qū) 5’ 端若干密碼子的堿基序列 核糖體結(jié)合位點的結(jié)構(gòu) 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達(dá)的影響 SD序列的影響 ： 一般來說， mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于 SD序列與 16S rRNA的堿基互補性，其中以 GGAG四個堿基序列尤為重要。 對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用 終止子也可以象啟動子那樣，通過特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基因組 DNA中克隆篩選 pCP1 Apr ori Tcr 篩選 Apr、 Tcs的轉(zhuǎn)化子 核糖體結(jié)合位點 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與 mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān)。 cI857阻遏蛋 在 42℃ 時失活脫落， PL便可介導(dǎo) 目的基因的表達(dá)。 在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去 色氨酸是困難的，因此基因工程 中往往添加 IAA誘導(dǎo) Ptrp介導(dǎo)的目 基因的表達(dá) 色氨酸 或加 3吲哚丙烯酸 高效轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白 （ IAA） Otrp Ptrp 高效轉(zhuǎn)錄 Otrp Ptrp 啟動子 啟動子的可控性 l噬菌體 啟動子 PlL的可控性： 噬菌體啟動子 PL受 CI阻遏蛋白阻 遏，很難直接誘導(dǎo)控制。因此， 基因工程中使用的乳糖啟動 子均為抗葡萄糖代謝阻遏的 突變型，即 Plac UV5 CAP cAMP cAMP濃度降低 Plac UV5 O 高效轉(zhuǎn)錄 啟動子 啟動子的可控性 Ptrp 色氨酸啟動子 Ptrp的可控性： Otrp 除去 色氨酸 色氨酸啟動子 Ptrp受色氨酸 阻遏 蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底 狀態(tài)。大腸桿菌基因工程 A 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌基因工程 大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢 全基因組測序，共有 4405個開放型閱讀框架 基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善 繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定 被美國 FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物 A 大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征 大腸桿菌基因工程 大腸桿菌表達(dá)外源基因的劣勢 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能 缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng) 內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白 細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素 B 外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理 大腸桿菌基因工程 啟動子 終止子 核糖體結(jié)合位點 密碼子 質(zhì)粒拷貝數(shù) 啟動子 啟動子最佳距離的探測 目的基因 E E A E E 啟動子 A 酶切開 Bal31酶解 目的基因 啟動子 啟動子的篩選 Apr ori galK pKO1 終止密碼子 采用鳥槍法戰(zhàn)略，將合適大小的 DNA片段 克隆到啟動子探針質(zhì)粒 pKO1上 受體細(xì)胞染色體 DNA上的 galE、 galT與質(zhì) 粒上報告基因 galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用， 可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì) 轉(zhuǎn)化 galE+、 galT+、 galK的大腸桿菌受體菌株 含有外源啟動子活性的重組克隆 啟動子 啟動子的構(gòu)建 35 區(qū)序列 10 區(qū)序列 PlL PrecA Ptrp Plac PtraA Ptac 啟動子 T T G A C A G A T A C T T T G A T A T A T A A T T T G A C A T T A A C T T A G A C A T A A T G T T T T A C A T A T A A T T T G A C A T A T A A T Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac 啟動子 啟動子的可控性 P 乳糖啟動子 Plac的可控性： O P O 高效轉(zhuǎn)錄 阻遏蛋白 誘導(dǎo) 乳糖 異丙基 bD硫代半乳糖苷（ IPTG） 野生型的 Plac與其控制區(qū) Olac 偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物 存在時，整個操縱子處于基 基底水平轉(zhuǎn)錄 底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使 啟動子 Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅 提高 啟動子 啟動子的可控性 Plac 乳糖啟動子 Plac的可控性： O Plac O 高效轉(zhuǎn)錄 葡萄糖代謝 野生型的 Plac上游附近擁有 代謝激活因子（ CAP） 結(jié)合 區(qū)， cAMP激活 CAP， CAP 基底水平轉(zhuǎn)錄 結(jié)合啟動子控制區(qū)，進(jìn)而促 進(jìn) Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖 代謝使 cAMP減少，也能阻 遏 Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸 基底水平轉(zhuǎn)錄 或者加入 3吲哚丙烯酸（ IAA）， 便可有效地解除阻遏抑制作用。在基因 工程中常使用溫度敏感型的 cI突 變基因 cI857控制 PL。但在大型細(xì)菌 培養(yǎng)罐中迅速升溫非常困難，因 此常使用一個雙質(zhì)?？刂葡到y(tǒng)， 用色氨酸間接控制目的基因表達(dá) Ptrp A B cI857 PL 目的基因 阻遏作用 Ptrp A B PL 表達(dá) 色氨酸 終止子 強化轉(zhuǎn)錄終止的必要性 外源基因在強啟動子的控制下表達(dá) ， 容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象 ， 即 RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的 DNA序列 ， 形成長短不一的 mRNA混合物 過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá) ， 其原因如下： 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長 ， RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子 mRNA所需的時間就相應(yīng)增加 ， 外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降； 如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或 DNA功能區(qū)域 ， 如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等 ， 則 RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能 ， 甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性； 過長的 mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì) ， 增加工程菌無謂的能量消耗； 更為嚴(yán)重的是 ， 過長的轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu) ， 從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率 終止子 強終止子的選擇與使用 目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌 rRNA操縱子上的rrnT1T2以及 T7噬菌體 DNA上的 Tf。大腸桿菌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)不同的 mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達(dá)數(shù)百倍。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成 C或 T， 均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達(dá)的影響 SD序列與起始密碼子之間的序列的影響 ： SD序列下游的堿基若為 AAAA或 UUUU， 翻譯效率最高；而CCCC或 GGGG的翻譯效率則分別是最高值的 50%和 25%。在很多情況下， SD序列位于 AUG之前大約 七個堿基 處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低 核糖體結(jié)合位點 核糖體結(jié)合位點對外源基因表達(dá)的影響 起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響 ： 大腸桿菌中的起始 tRNA分子可以同時識別 AUG、 GUG和 UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常 GUG為 AUG的 50%而 UUG只及 AUG的 25%。一般而言，有兩種策略 可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá)： 外源基因全合成 同步表達(dá)相關(guān) tRNA編碼基因 密碼子 密碼子偏愛性對外源基因表達(dá)的影響 按照大腸桿菌密碼子的偏愛性規(guī)律，設(shè)計更換外源基因中不適宜的相應(yīng)簡并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中的高效表達(dá)均采用了這種方法 外源基因全合成 密碼子 密碼子偏愛性對外源基因表達(dá)的影響 對于那些含有不和諧密碼子種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大的外源基因而言，則選擇相關(guān) tRNA編碼基因同步克隆表達(dá)的策略較為有利。為了提高人尿激酶原 cDNA在大腸桿菌中的高效表達(dá)，將大腸桿菌的這兩個 tRNA編碼基因克隆在另一個高表達(dá)的質(zhì)粒上。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達(dá)勢必會影響受體細(xì)胞的生長代謝，進(jìn)而導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達(dá)水平的下降 解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道 質(zhì)?？截悢?shù) 質(zhì)粒擴增時序的控制 pCP3擁有一個溫度可誘導(dǎo)型的復(fù)制子 pCP3 PL MCS ori Apr 在 28℃ 時，每個細(xì)胞的質(zhì)?？截悢?shù)為 60 在 42℃ 時，拷貝數(shù)迅速增至 300 600 在此溫度下，受體細(xì)胞染色體上的 CI基 因表達(dá)的溫度敏感型阻遏蛋白失活 因此，用一種手段同時控制質(zhì)?？? 貝數(shù)和基因的表達(dá) C 大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建策略 大腸桿菌基因工程 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 分泌型異源蛋白的表達(dá) 融合型異源蛋白的表達(dá) 寡聚型異源蛋白的表達(dá) 整合型異源蛋白的表達(dá) 蛋白酶抗性或缺陷型表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 包涵體型異源蛋白的表達(dá) 包涵體及其性質(zhì) 在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細(xì)胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結(jié)構(gòu)，這種水不溶性的結(jié)構(gòu)稱為 包涵體