【正文】 固氮效率和解決 “ 老區(qū)問題”。⑥腐熟劑，主要是加速高分子有機物分解為小分子養(yǎng)分物的腐生菌。 ②解磷菌，主要利用 巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)，把土壤中不溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟晌绽玫目扇苄粤姿猁}。微生物肥料的使用可減少化肥用量、減少能源資源消耗。 轉(zhuǎn)基因殺蟲抗病作物的推廣，無疑對微生物農(nóng)藥 的發(fā)展形成挑戰(zhàn)，但微生物農(nóng)藥具有可靠 的安全性、防治的有效性、防治對象的多樣性及生產(chǎn) 方式 的靈活性，難以被取代。 圖 166 螢光假單胞菌 合成蘇云金芽孢桿菌的 伴胞晶體 ， 用于開發(fā)生物囊殺蟲劑 (Gaertner et al., 1993) （ 2）基因工程抗病菌 放射農(nóng)桿菌 (Agrobacterium radiobacter) K84可產(chǎn)生 農(nóng)桿菌素 (agrocin) 84, 其組分為腺嘌呤脫氧阿拉伯糖苷氨基磷酸鹽，可有效地防治根癌農(nóng)桿菌 (A. tumefaciens)引起的桃、櫻桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病。將 Bt殺蚊 晶體蛋白 基因或 cry1A殺蟲晶體蛋白 基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，成功獲得殺蚊和殺蟲并 能 抗水稻紋枯病的重組菌。 由于 目前有關(guān)鏈霉菌的基因簇克隆和遺傳操作技術(shù)平臺已經(jīng)建立并日趨完善，隨著 現(xiàn)代分子生物學和生物信息學技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是聚酮生物合成調(diào)控的分子機理的闡明，人們 已經(jīng) 能 夠 有的放矢地利用抗生素基因簇資源，提高農(nóng)用抗生素產(chǎn)量與品種。其中 pBMB801B只含有來自 Bt的 DNA片段 且含有質(zhì)粒復制區(qū)，能夠在 Bt中穩(wěn)定復制，就像 Bt的內(nèi)源質(zhì)粒一樣； pBMB801E不含在 Bt中的復制單元，隨著菌體的復制而逐漸消失。 為 此 ，采用了 Bt轉(zhuǎn)座子中的位點特異性重組系統(tǒng)，在引入攜帶重組酶基因的輔助質(zhì)粒的幫助下，質(zhì)粒載體內(nèi)部發(fā)生重組，形成兩個質(zhì)粒，其中攜帶抗生素抗性基因和大腸桿菌基因片段的質(zhì)粒由于不能復制而丟失 ，保留來自 Bt的 DNA片段 。 （ 3）延長持效期 為了延長持效期，有人將芽孢形成較后階段的基因突變，使殺蟲基因正常表達，但芽孢不能完全成熟，細胞外殼相當于一層生物囊可保護伴胞晶體不受紫外線（ UV）等自然條件的不利影響。通過導入活力提高的殺蟲基因或雜合基因（ 如 cry1Ab 與 cry1C 基因的嵌合基因 ）也可提高殺蟲活性。 （ 1）增強殺蟲毒力 通過提高某個高毒力殺蟲基因的表達量在一定程度上可增強殺蟲活性。 Bt殺蟲蛋白 對農(nóng)業(yè)上許多重要作物害蟲具有專一毒殺性，而對 人、哺乳動物以及昆蟲的天敵非常安全。 近幾年來， 微生物 基因工程 農(nóng)藥 的研究十分活躍，并先于抗病蟲 轉(zhuǎn)基因 植物進入了實用化階段。微生物殺蟲劑中細菌類殺蟲劑以蘇云金芽孢桿菌推廣應用面積最大，而且殺蟲效果非常理想，此外，還有真菌殺蟲劑 、 病毒殺蟲劑等。 現(xiàn)在人們可以將源于微生物、動物、植物甚至源于人類的基因，轉(zhuǎn)移到諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 等細菌中，獲得了種種具有特殊能力的基因工程細菌。其二是制作生物反應 343 器，利用細菌來生產(chǎn)某種物質(zhì)。比如利用細胞表面技術(shù)開發(fā)細胞催化劑的時候，細胞表面酶的活性與游離酶相比往往降低；在構(gòu)建細胞表面蛋白庫的時候，有些蛋白的表達量太少以至于難以鑒定；還有空間阻礙、多亞基蛋白的表達、多種外源蛋白的同時表達等問題。為了將目的蛋白展示于微生物細胞表面，還需要構(gòu)建目的蛋白和外表面蛋白的融合。 整合載體 pDG1730的整合是有針對性的，其工作原理也可用于整合其它基因的整合載體的構(gòu)建，以及用于其它細菌整合載體的構(gòu)建。 pDG1730是典型的枯草芽孢桿菌整合載體，可將外源基因整合到 ?淀粉酶基因內(nèi)部。②具有一個雜合啟動子，它來源于乳糖操縱子的表達調(diào)控區(qū)域和枯草芽孢桿菌 SPO1菌株的啟動子區(qū)域，有利于外源蛋白的高 效合成。它們不僅是重要的工業(yè)菌種，也是基因表達研究的有價值材料，具有良好的分泌能力，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)條件簡便。多克隆序列中插入目 的基因， 340 使基因處于 Tn5 啟動子 (p)的控制之下。來源于 Tn5 的DNA 克隆片段包含兩個獨立而重疊的啟動子，每一個啟動子分別負責一個 Tn5 基因的轉(zhuǎn)錄。除了大腸桿菌以外，還有許多其他細菌的表達系統(tǒng)，但是目前對其他微生物在遺傳和分子生物學方面的研究程度不及大腸桿菌，幸運的是，適用于大腸桿菌的方法和策略也同樣可以應用于其他一些微生物。用鹽酸胍或尿素變性溶解包涵體中的蛋白質(zhì)，透析除去變性劑后，蛋白質(zhì)可重新折疊復性。另一種辦法是通過遺傳工程將革蘭氏陰性細菌改造成蛋白質(zhì)分泌型。 2． 構(gòu)建可分泌蛋白 ，分泌到胞外培養(yǎng)基中 通常位于蛋白質(zhì) N 端稱為信號肽 (信號序列，引導肽 )的一段氨基酸序列會幫助蛋白通過細胞膜。 在基因工程中，一般采用 UAA或一連串的終止密碼來有效終止原核細胞的翻譯。 2. 轉(zhuǎn)錄的有效性 為保證外源基因轉(zhuǎn)錄的有效性，在表達載體上應設法除去衰減序列 或插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列以避免轉(zhuǎn)錄的提前終止，促使 mRNA有效地延伸和終止。在細菌的代謝工程中，常見這種情況。 1. 啟動子的選擇 通過基因工程手段表達外源基因的目的大致有兩種，其一是超量表達，以達到最大限度地獲得 338 蛋白質(zhì)產(chǎn)物。對于克隆載體，只要滿足在宿主菌中復制和選擇要求的載體，都可用作克隆載體。 二、表達載體構(gòu)建原則 表達載體實際上是在克隆載體的基礎上裝載了用于表達的一些 元件 (cassette)，當外源基因插入到合適的位點后，在宿主菌中就可啟動表達。在細菌基因工程領(lǐng)域，大腸桿菌主要作為外源蛋白超量表達的平臺，其主要目的是對不同的蛋白質(zhì)進行體外超量表達，從而可以 將目標蛋白用于不同的下游領(lǐng)域，如制備基因工程疫苗、蛋白質(zhì)組學研究等等。 外源基因的表達水平不僅與基因的來源、基因的性質(zhì)以及載體有關(guān)，還取決于宿主細胞。同時要注意革新細菌基因工程菌的生產(chǎn)工藝，發(fā)展適用的加工劑型，盡快提高 ―下游 ‖技術(shù)的水平。由我國學者研制的轉(zhuǎn) ntrCnifA基因固氮斯氏假單胞菌 AC1541和蘇云金芽孢桿菌高產(chǎn)廣譜工程菌，均已通過農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會審批進入安全性評價的商品化生產(chǎn)階段，標志著我國一批擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組微生物農(nóng)藥、肥料和飼料用酶產(chǎn)品已初具 產(chǎn)業(yè)規(guī)模。目前至少有 70多個國家在研究、生產(chǎn)和使用微生物肥料，主要以根瘤菌劑和 植物促長細菌（ plant growthpromoting rhizobacteria, PGPR） 制劑為主。 在農(nóng)業(yè)上，據(jù)不完全統(tǒng)計，世界各國獲 準進入田間釋放的重組微生物占已登記在案的遺傳工 程菌環(huán)境釋放總數(shù)的 %，其中受體微生物為細菌的占 %、病毒 %、真菌 ％。 細菌工程菌與農(nóng) 業(yè)生產(chǎn) 各類農(nóng)業(yè)微生物的應用是實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護生態(tài)環(huán)境的有力保證。這些工業(yè)酶類的市場額（主要是食品、去污劑、紡織、皮革、造紙工業(yè)，而非醫(yī)藥業(yè)）在 2020年就已達到 2億美元。但已有少數(shù) 氨基酸、有機酸 及維生素 等重要發(fā)酵產(chǎn)品 是以基因工程菌 代替現(xiàn)有的菌種進行 工業(yè)化生產(chǎn)，并 獲得了巨大成功 。在工業(yè)和生活廢水治理、重金屬污染土壤的 生物修復 (bioremediation)、農(nóng)藥殘留的微生物降解、生物制漿和生物漂白等清潔生產(chǎn)技術(shù)的建立、石油污染的消除以及友好可再生 材料的合成等諸多方面，環(huán)境微生物基因工程菌取得了很大的技術(shù)突破，推動了傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)工藝革新和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，保護了環(huán)境，維持了地球生態(tài)環(huán)境的平衡。與化學、物理等其他技術(shù)相比，環(huán)境微生物基因工程技術(shù)具有效率高、成本低、反應條件溫和以及無二次污染等顯著優(yōu)點，同時還可以增強自然環(huán)境的自我凈化能力。 未來市場前景廣闊的藥 品 將集中 在 單克隆抗體、反義藥物、基因治療藥物、可溶性蛋白質(zhì)類藥物和疫苗 等五 個類別中 ， 其中單克隆抗體的市場需求最令人注目，當前處于臨床試驗的各類單克隆抗體約 100個， 約 占在研生物技術(shù)藥品 總 數(shù)的 25%，目前全球單克隆抗體市場銷售額已達到 40億美元。 二十三年以來 基因工程 的 技術(shù)成果６０％集中應用于醫(yī)藥工業(yè)，為生物醫(yī)藥的發(fā)展帶來一場 嶄 新的革命 。 細菌不僅在現(xiàn)代生物技術(shù)的核心 —基因重組技術(shù)的誕生和技術(shù)進步中起到舉足輕重的作用，而且細菌的遺傳改造也是基因工程中歷史最早、研究最廣泛、取得實際應用成果最多的領(lǐng)域。 334 第十六章 細菌基因工程 第一節(jié) 細菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 一、細菌基因工程的發(fā)展簡史 細菌與基因工程密不可分。幾年后，第一個基因工程產(chǎn)品 ──利用構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)人胰島素獲得成功，從此人類進入了生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)時代。 二、 細菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀 細菌工程菌與人類藥物生產(chǎn) 1982年美國首先將重組胰島素投放市場，標志著世界第一個基因工程藥物的誕生。 細菌 基因工程藥物 已 成為制藥行業(yè)的一支奇兵， 基因 工程 制 藥 已 成為 21世紀 制 藥業(yè)的支柱。它主要采用現(xiàn)代分 子生物學和分子生態(tài)學的原理和方法，充分利用環(huán)境微生物的生物凈化、生物轉(zhuǎn)化和生物催化等特性的功能基因，構(gòu)建高效表達的基因工程菌進行污染治理、清潔生產(chǎn)和可再生資源利用，多層面和全方位地解決工業(yè)和生活廢棄物污染、石油和煤炭脫硫、農(nóng)藥殘留、能源和材料短缺等問 題。分解其它有機物甚至 致癌物、有機汞以及有 效固定環(huán)境中重金屬離子的工程菌也展現(xiàn)在世人面前。理論上所有發(fā)酵食品與食品配料生產(chǎn)菌，都可以利用基因工程技術(shù)進行菌種改良，但是由于氨基酸、有機酸、維生素、色素、香料等均屬于微生物代謝產(chǎn)物，其生產(chǎn)菌的遺傳改造所涉及的基因較多且調(diào)控復雜，因此增加了利用基因工程技術(shù)進行菌種改良的難度，目前這方面的工作大多還處于研究階段。除食品用酶制劑外， 細菌基因工程菌也已成功應用于生產(chǎn)其他不同目的的酶，如用于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為高果糖糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶； 應用于 PCR的耐熱 DNA聚合酶； 用于生產(chǎn)青霉素母核的青霉素?；福迷谙匆路壑械膲A性蛋白酶以及飼料用酶。在許多工業(yè)領(lǐng)域里，通過這些方法得到的產(chǎn)品每年都在遞增?，F(xiàn)代生物科學技術(shù)的發(fā)展給農(nóng)業(yè)微生物研究注入了新的活力，特別是近年來基因工程的研究為微生物遺傳改良提供了有效手段，使農(nóng)業(yè)微生物發(fā)展成為生命科學領(lǐng)域中最為活躍、最具創(chuàng)新性的前沿之一。國際水稻研究所計劃在 10年的時間內(nèi)構(gòu)建一種超級固氮細菌，以減少水稻 50%的氮肥用量。 目前，中國是世界上農(nóng)業(yè)重組微生物環(huán)境釋放面積最大、種類最多和研究范圍最廣的國家，在我國境內(nèi)申報并通過農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會批準的農(nóng)業(yè)重組微生物在 40例以上，目前還有十余株轉(zhuǎn)基因細菌處于安全性評價和田間試驗階段。細菌基因工程的研究重 337 點將會放在細菌資源的發(fā)掘和利用上，即從現(xiàn)存豐富的細菌資源中鑒定分離具有殺菌、殺蟲、防病、除草、固氮、促生、抗逆、降解污染物 、促進養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等各種功能的新基因，以及難培養(yǎng)和極端環(huán)境微生物資源的開發(fā)利用，為構(gòu)建多方位滿足人類需要的基因工程菌打下牢固基礎。 第二節(jié) 細菌基因工程的表達系統(tǒng) 一、細菌基因工程的表達系統(tǒng) 細菌基因工程的表達系統(tǒng)由三部分組成：外源基因、表達載體和宿主 細菌。 大腸桿菌是目前研究最深入、使用最廣泛的基因工程宿主菌。本節(jié)主要介紹細菌基因工程中 構(gòu)建表達載體的一般原則及其它 常見的一些表達系統(tǒng)。因此，表達載體的構(gòu)建主要體現(xiàn)在表達元件的選擇和利用?？寺≥d體可以是質(zhì)粒載體，也可以是將外源基因整合到染色體上的整合載體。在這種情況下，不一定要高量表達，正常表達就可，往往可采用基因自身的啟動子或宿主 菌的相關(guān)性狀基因的啟動子。詳細內(nèi)容見后文。要使翻譯起始效率最高，要滿足以下條件：①選用最佳起始密碼子 AUG（偶爾為 GUG和 UUG） ； ② SD序列 （ ShineDalgarno sequence） 接 近 或與以下 序 列完全相同 ：5′ ?AG GAGG?3 ′ ； ③ 除 SD序列外 ， 處于起始密碼前的兩個核苷酸應該是 A和 U；④ 如果在起始密碼 AUG后的序列是 GCAU或 AAAA序列 ， 能使翻譯效率提高；⑤在翻譯起始區(qū)不能形成明顯的二級結(jié)構(gòu)。 利用tag的特性通?？梢詫θ诤系鞍走M行親和層析等分離提純， 因此 選擇融合表達 既 可以保護外源蛋白不受宿主內(nèi)蛋白酶的降解，同時也大大 簡化 了 重組蛋白的純化 過程 。因此可使用革蘭氏陽性細菌或真核生物細胞，它們都缺少外膜，能直接分泌蛋白進入培養(yǎng)基。通過超聲波破碎、離心 等 能 較 容易地對之進行初級純化。 四、常見細菌表達系統(tǒng) 大腸桿菌并不一 定是所有外源蛋白表達的理想微生物。 革蘭氏陰性細菌通用的表達載體 革蘭氏陰性細菌通用的表達載體如 pAV10 等都是在低拷貝數(shù)、廣宿主質(zhì)粒 pRK290 的 多克隆位點中插入來源于轉(zhuǎn)座子 Tn5 末端反向重復序列的一段 70bp DNA 而構(gòu)建的 (圖 161)。 圖 161 克隆載體 pAV10 四環(huán)素抗性基因 (Tetr)；單個 BglII 限制性內(nèi)切酶位點；復制起點 (ori)；啟動子 (p)；多克隆位點 (MCS)。它 最顯著的特點是在極端生長條件或生命后期在細胞內(nèi)形成中生芽孢 ， 芽孢具有極強的抗逆境能力。 pDG148Stu克隆表達載體的結(jié)構(gòu)特點：①具有乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因 lacI及其調(diào)控序列，使外源蛋白的表達受 IPTG的調(diào)控。 （ 2）整合載體 能 將目標基因整合到宿主的基因組 中 的載體稱為 整合載體 (integration vector), 一般通過同源 重組或轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座特性實現(xiàn)外源基因的整合。只有當載體上的 ?淀粉酶基 因與宿主染色體上 ?淀粉酶基因發(fā)生同源重組， 通過雙交叉置換，目的基因和抗