【正文】 固氮效率和解決 “ 老區(qū)問題”。⑥腐熟劑，主要是加速高分子有機(jī)物分解為小分子養(yǎng)分物的腐生菌。 ②解磷菌，主要利用 巨大芽孢桿菌 (Bacillus megaterium)，把土壤中不溶性磷轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锟晌绽玫目扇苄粤姿猁}。微生物肥料的使用可減少化肥用量、減少能源資源消耗。 轉(zhuǎn)基因殺蟲抗病作物的推廣，無疑對(duì)微生物農(nóng)藥 的發(fā)展形成挑戰(zhàn)，但微生物農(nóng)藥具有可靠 的安全性、防治的有效性、防治對(duì)象的多樣性及生產(chǎn) 方式 的靈活性，難以被取代。 圖 166 螢光假單胞菌 合成蘇云金芽孢桿菌的 伴胞晶體 ， 用于開發(fā)生物囊殺蟲劑 (Gaertner et al., 1993) （ 2）基因工程抗病菌 放射農(nóng)桿菌 (Agrobacterium radiobacter) K84可產(chǎn)生 農(nóng)桿菌素 (agrocin) 84, 其組分為腺嘌呤脫氧阿拉伯糖苷氨基磷酸鹽，可有效地防治根癌農(nóng)桿菌 (A. tumefaciens)引起的桃、櫻桃、葡萄、玫瑰等植物的根癌病。將 Bt殺蚊 晶體蛋白 基因或 cry1A殺蟲晶體蛋白 基因轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌，成功獲得殺蚊和殺蟲并 能 抗水稻紋枯病的重組菌。 由于 目前有關(guān)鏈霉菌的基因簇克隆和遺傳操作技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)建立并日趨完善，隨著 現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是聚酮生物合成調(diào)控的分子機(jī)理的闡明，人們 已經(jīng) 能 夠 有的放矢地利用抗生素基因簇資源，提高農(nóng)用抗生素產(chǎn)量與品種。其中 pBMB801B只含有來自 Bt的 DNA片段 且含有質(zhì)粒復(fù)制區(qū)，能夠在 Bt中穩(wěn)定復(fù)制，就像 Bt的內(nèi)源質(zhì)粒一樣； pBMB801E不含在 Bt中的復(fù)制單元，隨著菌體的復(fù)制而逐漸消失。 為 此 ，采用了 Bt轉(zhuǎn)座子中的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，在引入攜帶重組酶基因的輔助質(zhì)粒的幫助下，質(zhì)粒載體內(nèi)部發(fā)生重組，形成兩個(gè)質(zhì)粒，其中攜帶抗生素抗性基因和大腸桿菌基因片段的質(zhì)粒由于不能復(fù)制而丟失 ，保留來自 Bt的 DNA片段 。 （ 3）延長(zhǎng)持效期 為了延長(zhǎng)持效期，有人將芽孢形成較后階段的基因突變，使殺蟲基因正常表達(dá)，但芽孢不能完全成熟，細(xì)胞外殼相當(dāng)于一層生物囊可保護(hù)伴胞晶體不受紫外線（ UV）等自然條件的不利影響。通過導(dǎo)入活力提高的殺蟲基因或雜合基因（ 如 cry1Ab 與 cry1C 基因的嵌合基因 ）也可提高殺蟲活性。 （ 1）增強(qiáng)殺蟲毒力 通過提高某個(gè)高毒力殺蟲基因的表達(dá)量在一定程度上可增強(qiáng)殺蟲活性。 Bt殺蟲蛋白 對(duì)農(nóng)業(yè)上許多重要作物害蟲具有專一毒殺性，而對(duì) 人、哺乳動(dòng)物以及昆蟲的天敵非常安全。 近幾年來， 微生物 基因工程 農(nóng)藥 的研究十分活躍，并先于抗病蟲 轉(zhuǎn)基因 植物進(jìn)入了實(shí)用化階段。微生物殺蟲劑中細(xì)菌類殺蟲劑以蘇云金芽孢桿菌推廣應(yīng)用面積最大，而且殺蟲效果非常理想，此外，還有真菌殺蟲劑 、 病毒殺蟲劑等。 現(xiàn)在人們可以將源于微生物、動(dòng)物、植物甚至源于人類的基因，轉(zhuǎn)移到諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 等細(xì)菌中，獲得了種種具有特殊能力的基因工程細(xì)菌。其二是制作生物反應(yīng) 343 器，利用細(xì)菌來生產(chǎn)某種物質(zhì)。比如利用細(xì)胞表面技術(shù)開發(fā)細(xì)胞催化劑的時(shí)候，細(xì)胞表面酶的活性與游離酶相比往往降低；在構(gòu)建細(xì)胞表面蛋白庫的時(shí)候，有些蛋白的表達(dá)量太少以至于難以鑒定；還有空間阻礙、多亞基蛋白的表達(dá)、多種外源蛋白的同時(shí)表達(dá)等問題。為了將目的蛋白展示于微生物細(xì)胞表面，還需要構(gòu)建目的蛋白和外表面蛋白的融合。 整合載體 pDG1730的整合是有針對(duì)性的，其工作原理也可用于整合其它基因的整合載體的構(gòu)建，以及用于其它細(xì)菌整合載體的構(gòu)建。 pDG1730是典型的枯草芽孢桿菌整合載體，可將外源基因整合到 ?淀粉酶基因內(nèi)部。②具有一個(gè)雜合啟動(dòng)子，它來源于乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控區(qū)域和枯草芽孢桿菌 SPO1菌株的啟動(dòng)子區(qū)域，有利于外源蛋白的高 效合成。它們不僅是重要的工業(yè)菌種，也是基因表達(dá)研究的有價(jià)值材料，具有良好的分泌能力，遺傳背景清楚，生長(zhǎng)迅速，培養(yǎng)條件簡(jiǎn)便。多克隆序列中插入目 的基因， 340 使基因處于 Tn5 啟動(dòng)子 (p)的控制之下。來源于 Tn5 的DNA 克隆片段包含兩個(gè)獨(dú)立而重疊的啟動(dòng)子，每一個(gè)啟動(dòng)子分別負(fù)責(zé)一個(gè) Tn5 基因的轉(zhuǎn)錄。除了大腸桿菌以外，還有許多其他細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)，但是目前對(duì)其他微生物在遺傳和分子生物學(xué)方面的研究程度不及大腸桿菌，幸運(yùn)的是，適用于大腸桿菌的方法和策略也同樣可以應(yīng)用于其他一些微生物。用鹽酸胍或尿素變性溶解包涵體中的蛋白質(zhì)，透析除去變性劑后，蛋白質(zhì)可重新折疊復(fù)性。另一種辦法是通過遺傳工程將革蘭氏陰性細(xì)菌改造成蛋白質(zhì)分泌型。 2． 構(gòu)建可分泌蛋白 ，分泌到胞外培養(yǎng)基中 通常位于蛋白質(zhì) N 端稱為信號(hào)肽 (信號(hào)序列，引導(dǎo)肽 )的一段氨基酸序列會(huì)幫助蛋白通過細(xì)胞膜。 在基因工程中，一般采用 UAA或一連串的終止密碼來有效終止原核細(xì)胞的翻譯。 2. 轉(zhuǎn)錄的有效性 為保證外源基因轉(zhuǎn)錄的有效性，在表達(dá)載體上應(yīng)設(shè)法除去衰減序列 或插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列以避免轉(zhuǎn)錄的提前終止，促使 mRNA有效地延伸和終止。在細(xì)菌的代謝工程中，常見這種情況。 1. 啟動(dòng)子的選擇 通過基因工程手段表達(dá)外源基因的目的大致有兩種，其一是超量表達(dá)，以達(dá)到最大限度地獲得 338 蛋白質(zhì)產(chǎn)物。對(duì)于克隆載體，只要滿足在宿主菌中復(fù)制和選擇要求的載體，都可用作克隆載體。 二、表達(dá)載體構(gòu)建原則 表達(dá)載體實(shí)際上是在克隆載體的基礎(chǔ)上裝載了用于表達(dá)的一些 元件 (cassette)，當(dāng)外源基因插入到合適的位點(diǎn)后，在宿主菌中就可啟動(dòng)表達(dá)。在細(xì)菌基因工程領(lǐng)域，大腸桿菌主要作為外源蛋白超量表達(dá)的平臺(tái)，其主要目的是對(duì)不同的蛋白質(zhì)進(jìn)行體外超量表達(dá)，從而可以 將目標(biāo)蛋白用于不同的下游領(lǐng)域，如制備基因工程疫苗、蛋白質(zhì)組學(xué)研究等等。 外源基因的表達(dá)水平不僅與基因的來源、基因的性質(zhì)以及載體有關(guān)，還取決于宿主細(xì)胞。同時(shí)要注意革新細(xì)菌基因工程菌的生產(chǎn)工藝，發(fā)展適用的加工劑型，盡快提高 ―下游 ‖技術(shù)的水平。由我國學(xué)者研制的轉(zhuǎn) ntrCnifA基因固氮斯氏假單胞菌 AC1541和蘇云金芽孢桿菌高產(chǎn)廣譜工程菌，均已通過農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會(huì)審批進(jìn)入安全性評(píng)價(jià)的商品化生產(chǎn)階段，標(biāo)志著我國一批擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重組微生物農(nóng)藥、肥料和飼料用酶產(chǎn)品已初具 產(chǎn)業(yè)規(guī)模。目前至少有 70多個(gè)國家在研究、生產(chǎn)和使用微生物肥料，主要以根瘤菌劑和 植物促長(zhǎng)細(xì)菌（ plant growthpromoting rhizobacteria, PGPR） 制劑為主。 在農(nóng)業(yè)上，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，世界各國獲 準(zhǔn)進(jìn)入田間釋放的重組微生物占已登記在案的遺傳工 程菌環(huán)境釋放總數(shù)的 %，其中受體微生物為細(xì)菌的占 %、病毒 %、真菌 ％。 細(xì)菌工程菌與農(nóng) 業(yè)生產(chǎn) 各類農(nóng)業(yè)微生物的應(yīng)用是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和保護(hù)生態(tài)環(huán)境的有力保證。這些工業(yè)酶類的市場(chǎng)額（主要是食品、去污劑、紡織、皮革、造紙工業(yè)，而非醫(yī)藥業(yè)）在 2020年就已達(dá)到 2億美元。但已有少數(shù) 氨基酸、有機(jī)酸 及維生素 等重要發(fā)酵產(chǎn)品 是以基因工程菌 代替現(xiàn)有的菌種進(jìn)行 工業(yè)化生產(chǎn)，并 獲得了巨大成功 。在工業(yè)和生活廢水治理、重金屬污染土壤的 生物修復(fù) (bioremediation)、農(nóng)藥殘留的微生物降解、生物制漿和生物漂白等清潔生產(chǎn)技術(shù)的建立、石油污染的消除以及友好可再生 材料的合成等諸多方面，環(huán)境微生物基因工程菌取得了很大的技術(shù)突破，推動(dòng)了傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的技術(shù)工藝革新和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，保護(hù)了環(huán)境，維持了地球生態(tài)環(huán)境的平衡。與化學(xué)、物理等其他技術(shù)相比，環(huán)境微生物基因工程技術(shù)具有效率高、成本低、反應(yīng)條件溫和以及無二次污染等顯著優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)還可以增強(qiáng)自然環(huán)境的自我凈化能力。 未來市場(chǎng)前景廣闊的藥 品 將集中 在 單克隆抗體、反義藥物、基因治療藥物、可溶性蛋白質(zhì)類藥物和疫苗 等五 個(gè)類別中 ， 其中單克隆抗體的市場(chǎng)需求最令人注目，當(dāng)前處于臨床試驗(yàn)的各類單克隆抗體約 100個(gè)， 約 占在研生物技術(shù)藥品 總 數(shù)的 25%，目前全球單克隆抗體市場(chǎng)銷售額已達(dá)到 40億美元。 二十三年以來 基因工程 的 技術(shù)成果６０％集中應(yīng)用于醫(yī)藥工業(yè)，為生物醫(yī)藥的發(fā)展帶來一場(chǎng) 嶄 新的革命 。 細(xì)菌不僅在現(xiàn)代生物技術(shù)的核心 —基因重組技術(shù)的誕生和技術(shù)進(jìn)步中起到舉足輕重的作用，而且細(xì)菌的遺傳改造也是基因工程中歷史最早、研究最廣泛、取得實(shí)際應(yīng)用成果最多的領(lǐng)域。 334 第十六章 細(xì)菌基因工程 第一節(jié) 細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì) 一、細(xì)菌基因工程的發(fā)展簡(jiǎn)史 細(xì)菌與基因工程密不可分。幾年后，第一個(gè)基因工程產(chǎn)品 ──利用構(gòu)建的基因工程菌生產(chǎn)人胰島素獲得成功，從此人類進(jìn)入了生物技術(shù)的產(chǎn)業(yè)時(shí)代。 二、 細(xì)菌基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀 細(xì)菌工程菌與人類藥物生產(chǎn) 1982年美國首先將重組胰島素投放市場(chǎng)，標(biāo)志著世界第一個(gè)基因工程藥物的誕生。 細(xì)菌 基因工程藥物 已 成為制藥行業(yè)的一支奇兵， 基因 工程 制 藥 已 成為 21世紀(jì) 制 藥業(yè)的支柱。它主要采用現(xiàn)代分 子生物學(xué)和分子生態(tài)學(xué)的原理和方法，充分利用環(huán)境微生物的生物凈化、生物轉(zhuǎn)化和生物催化等特性的功能基因，構(gòu)建高效表達(dá)的基因工程菌進(jìn)行污染治理、清潔生產(chǎn)和可再生資源利用，多層面和全方位地解決工業(yè)和生活廢棄物污染、石油和煤炭脫硫、農(nóng)藥殘留、能源和材料短缺等問 題。分解其它有機(jī)物甚至 致癌物、有機(jī)汞以及有 效固定環(huán)境中重金屬離子的工程菌也展現(xiàn)在世人面前。理論上所有發(fā)酵食品與食品配料生產(chǎn)菌，都可以利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌種改良，但是由于氨基酸、有機(jī)酸、維生素、色素、香料等均屬于微生物代謝產(chǎn)物，其生產(chǎn)菌的遺傳改造所涉及的基因較多且調(diào)控復(fù)雜，因此增加了利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌種改良的難度，目前這方面的工作大多還處于研究階段。除食品用酶制劑外， 細(xì)菌基因工程菌也已成功應(yīng)用于生產(chǎn)其他不同目的的酶，如用于將葡萄糖轉(zhuǎn)化為高果糖糖漿的葡萄糖異構(gòu)酶； 應(yīng)用于 PCR的耐熱 DNA聚合酶； 用于生產(chǎn)青霉素母核的青霉素?；福迷谙匆路壑械膲A性蛋白酶以及飼料用酶。在許多工業(yè)領(lǐng)域里，通過這些方法得到的產(chǎn)品每年都在遞增。現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展給農(nóng)業(yè)微生物研究注入了新的活力，特別是近年來基因工程的研究為微生物遺傳改良提供了有效手段，使農(nóng)業(yè)微生物發(fā)展成為生命科學(xué)領(lǐng)域中最為活躍、最具創(chuàng)新性的前沿之一。國際水稻研究所計(jì)劃在 10年的時(shí)間內(nèi)構(gòu)建一種超級(jí)固氮細(xì)菌，以減少水稻 50%的氮肥用量。 目前，中國是世界上農(nóng)業(yè)重組微生物環(huán)境釋放面積最大、種類最多和研究范圍最廣的國家，在我國境內(nèi)申報(bào)并通過農(nóng)業(yè)生物基因工程安全委員會(huì)批準(zhǔn)的農(nóng)業(yè)重組微生物在 40例以上，目前還有十余株轉(zhuǎn)基因細(xì)菌處于安全性評(píng)價(jià)和田間試驗(yàn)階段。細(xì)菌基因工程的研究重 337 點(diǎn)將會(huì)放在細(xì)菌資源的發(fā)掘和利用上，即從現(xiàn)存豐富的細(xì)菌資源中鑒定分離具有殺菌、殺蟲、防病、除草、固氮、促生、抗逆、降解污染物 、促進(jìn)養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等各種功能的新基因，以及難培養(yǎng)和極端環(huán)境微生物資源的開發(fā)利用，為構(gòu)建多方位滿足人類需要的基因工程菌打下牢固基礎(chǔ)。 第二節(jié) 細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng) 一、細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng) 細(xì)菌基因工程的表達(dá)系統(tǒng)由三部分組成：外源基因、表達(dá)載體和宿主 細(xì)菌。 大腸桿菌是目前研究最深入、使用最廣泛的基因工程宿主菌。本節(jié)主要介紹細(xì)菌基因工程中 構(gòu)建表達(dá)載體的一般原則及其它 常見的一些表達(dá)系統(tǒng)。因此，表達(dá)載體的構(gòu)建主要體現(xiàn)在表達(dá)元件的選擇和利用?？寺≥d體可以是質(zhì)粒載體，也可以是將外源基因整合到染色體上的整合載體。在這種情況下，不一定要高量表達(dá)，正常表達(dá)就可，往往可采用基因自身的啟動(dòng)子或宿主 菌的相關(guān)性狀基因的啟動(dòng)子。詳細(xì)內(nèi)容見后文。要使翻譯起始效率最高，要滿足以下條件：①選用最佳起始密碼子 AUG（偶爾為 GUG和 UUG） ； ② SD序列 （ ShineDalgarno sequence） 接 近 或與以下 序 列完全相同 ：5′ ?AG GAGG?3 ′ ； ③ 除 SD序列外 ， 處于起始密碼前的兩個(gè)核苷酸應(yīng)該是 A和 U；④ 如果在起始密碼 AUG后的序列是 GCAU或 AAAA序列 ， 能使翻譯效率提高；⑤在翻譯起始區(qū)不能形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 利用tag的特性通常可以對(duì)融合蛋白進(jìn)行親和層析等分離提純， 因此 選擇融合表達(dá) 既 可以保護(hù)外源蛋白不受宿主內(nèi)蛋白酶的降解，同時(shí)也大大 簡(jiǎn)化 了 重組蛋白的純化 過程 。因此可使用革蘭氏陽性細(xì)菌或真核生物細(xì)胞，它們都缺少外膜，能直接分泌蛋白進(jìn)入培養(yǎng)基。通過超聲波破碎、離心 等 能 較 容易地對(duì)之進(jìn)行初級(jí)純化。 四、常見細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌并不一 定是所有外源蛋白表達(dá)的理想微生物。 革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體 革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體如 pAV10 等都是在低拷貝數(shù)、廣宿主質(zhì)粒 pRK290 的 多克隆位點(diǎn)中插入來源于轉(zhuǎn)座子 Tn5 末端反向重復(fù)序列的一段 70bp DNA 而構(gòu)建的 (圖 161)。 圖 161 克隆載體 pAV10 四環(huán)素抗性基因 (Tetr)；單個(gè) BglII 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)；復(fù)制起點(diǎn) (ori)；啟動(dòng)子 (p)；多克隆位點(diǎn) (MCS)。它 最顯著的特點(diǎn)是在極端生長(zhǎng)條件或生命后期在細(xì)胞內(nèi)形成中生芽孢 ， 芽孢具有極強(qiáng)的抗逆境能力。 pDG148Stu克隆表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①具有乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因 lacI及其調(diào)控序列，使外源蛋白的表達(dá)受 IPTG的調(diào)控。 （ 2）整合載體 能 將目標(biāo)基因整合到宿主的基因組 中 的載體稱為 整合載體 (integration vector), 一般通過同源 重組或轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座特性實(shí)現(xiàn)外源基因的整合。只有當(dāng)載體上的 ?淀粉酶基 因與宿主染色體上 ?淀粉酶基因發(fā)生同源重組， 通過雙交叉置換，目的基因和抗