【正文】 2. 轉錄的有效性 為保證外源基因轉錄的有效性，在表達載體上應設法除去衰減序列 或插入抗轉錄終止序列以避免轉錄的提前終止，促使 mRNA有效地延伸和終止。也可在終止密碼子后增加終止子序列，使轉錄有效終止，并延長 mRNA的半衰期。 3. 翻譯起始的有效性 翻譯起始是多種成分包括 mRNA、 16SrRNA、 fMettRNA，核糖體 S1蛋白、蛋白合成起始因子之間的協(xié)同作用的過程。要使翻譯起始效率最高，要滿足以下條件：①選用最佳起始密碼子 AUG（偶爾為 GUG和 UUG） ； ② SD序列 （ ShineDalgarno sequence） 接 近 或與以下 序 列完全相同 ：5′ ?AG GAGG?3 ′ ； ③ 除 SD序列外 ， 處于起始密碼前的兩個核苷酸應該是 A和 U；④ 如果在起始密碼 AUG后的序列是 GCAU或 AAAA序列 ， 能使翻譯效率提高；⑤在翻譯起始區(qū)不能形成明顯的二級結構。 在基因工程中，一般采用 UAA或一連串的終止密碼來有效終止原核細胞的翻譯。 三、外源基因表達的方式 1． 外源基因以 融合 蛋白形式表達 融合表達是指目標基因與 編碼 具有特殊活性的 多肽或蛋白質的基因 融合，構建成一個融合蛋白基因。用于融合的表達標簽 (tag)蛋白和多肽有 六聚組氨酸肽 (6xHis)和 谷胱甘肽 S轉移酶 (GST)。 利用tag的特性通常可以對融合蛋白進行親和層析等分離提純， 因此 選擇融合表達 既 可以保護外源蛋白不受宿主內蛋白酶的降解，同時也大大 簡化 了 重組蛋白的純化 過程 。 2． 構建可分泌蛋白 ，分泌到胞外培養(yǎng)基中 通常位于蛋白質 N 端稱為信號肽 (信號序列，引導肽 )的一段氨基酸序列會幫助蛋白通過細胞膜。通過基因操作 可在 外源蛋白的 N 端 添加編碼信號肽的 DNA 序列，形成一個分泌蛋白。然而，僅僅是信號肽序列的存在并不能確保高效分泌，并且大腸桿菌和其他革蘭氏陰性細菌由于外膜的存在，也不能使分泌蛋白進 入周圍的培養(yǎng)基。因此可使用革蘭氏陽性細菌或真核生物細胞，它們都缺少外膜，能直接分泌蛋白進入培養(yǎng)基。另一種辦法是通過遺傳工程將革蘭氏陰性細菌改造成蛋白質分泌型。 3．外源蛋白在宿主細胞中以包涵體的形式表達 339 包涵體是致密的不溶性復合物，含有大部分的表達蛋白， 可以抵抗宿主細胞中蛋白水解酶的降解，也便于純化。 一些以可溶性蛋白形式表達時易被降解的蛋白質，以包涵體形式表達時卻可以很穩(wěn)定。通過超聲波破碎、離心 等 能 較 容易地對之進行初級純化。用鹽酸胍或尿素變性溶解包涵體中的蛋白質，透析除去變性劑后，蛋白質可重新折疊復性。然而 這種方法 也有缺陷 ，經變性 /復性后正確折疊的蛋白質的產量不穩(wěn)定，有時會很低，更有些蛋白尤其是 分子量較 大 的 蛋白基本上不能正確進行重折疊， 目前研究人員正在努力尋求出一種穩(wěn)定 、 高效表達的技術 以 獲得具有天然構象和高活性的蛋白質。 4. 外源基因在 細胞表面的表達（表面展示技術） 微生物 細胞表面展示（ cell surface display）技術是把目的蛋白基因序列 (外源蛋白 )與特定的載體蛋白基因序列 (又叫定位序列 )融合后導入微生物宿主細胞，從而使目的蛋白表達并定位于微生物細胞表面。 四、常見細菌表達系統(tǒng) 大腸桿菌并不一 定是所有外源蛋白表達的理想微生物。除了大腸桿菌以外，還有許多其他細菌的表達系統(tǒng)，但是目前對其他微生物在遺傳和分子生物學方面的研究程度不及大腸桿菌，幸運的是，適用于大腸桿菌的方法和策略也同樣可以應用于其他一些微生物。因此，其他細菌沒有可專門利用的通用型表達載體，通常研究者只有在使用它們時才構建特異性或專一性的表達載體。在下面的章節(jié)里，主要介紹幾種比較常見的其他細菌基因工程表達系統(tǒng)的結構和特點。 革蘭氏陰性細菌通用的表達載體 革蘭氏陰性細菌通用的表達載體如 pAV10 等都是在低拷貝數、廣宿主質粒 pRK290 的 多克隆位點中插入來源于轉座子 Tn5 末端反向重復序列的一段 70bp DNA 而構建的 (圖 161)。來源于 Tn5 的DNA 克隆片段包含兩個獨立而重疊的啟動子，每一個啟動子分別負責一個 Tn5 基因的轉錄。 Tn5 能有效地作用于許多細菌宿主，它的啟動子也能促進這些生物的轉錄。 在其它革蘭氏 陰性細菌中所用的表達載體與此類似，但使用的并不多。 圖 161 克隆載體 pAV10 四環(huán)素抗性基因 (Tetr)；單個 BglII 限制性內切酶位點；復制起點 (ori)；啟動子 (p)；多克隆位點 (MCS)。多克隆序列中插入目 的基因， 340 使基因處于 Tn5 啟動子 (p)的控制之下。箭頭表示轉錄的方向。 芽孢桿菌表達系統(tǒng) 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)是一種革蘭氏陽性、無莢膜、能運動的桿狀細菌 ，無致病性，對人畜無毒，是 革蘭氏陽性細菌的主要代表 。它 最顯著的特點是在極端生長條件或生命后期在細胞內形成中生芽孢 ， 芽孢具有極強的抗逆境能力。它們不僅是重要的工業(yè)菌種，也是基因表達研究的有價值材料，具有良好的分泌能力，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)條件簡便。 下面介紹兩個應用于枯草芽孢桿菌的表達載體。 （ 1） 穿梭型表達載體 作為 穿梭型表達載體 (shuttle vector)， 應同時具有大腸桿菌載體和枯草芽孢桿菌載體的復制起點 ， pDG148Stu就 是一個穿梭型表達載體 （ 圖 162），它利用大腸桿菌 pBR322和枯草芽孢桿菌載體 pVB110的復制起點 ， 能夠超量表達插入其 StuI酶切位點的外源蛋白。 pDG148Stu克隆表達載體的結構特點：①具有乳糖操縱子調節(jié)基因 lacI及其調控序列，使外源蛋白的表達受 IPTG的調控。②具有一個雜合啟動子，它來源于乳糖操縱子的表達調控區(qū)域和枯草芽孢桿菌 SPO1菌株的啟動子區(qū)域，有利于外源蛋白的高 效合成。③ 3個抗性基因作為篩選標記， kan（卡那霉素抗性基因）和 ble(博萊霉素抗性基因）可同時用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗性篩選， bla（氨芐霉素抗性基因）只能用于大腸桿菌的抗性標記。 圖 162 pDG148Stu表達載體的結構 ble：博萊霉素抗性基因； bla：氨芐霉素抗性基因； kan：卡那霉素抗性基因； Pspac：雜合啟動子； lacI：乳糖操縱子阻遏蛋白基因。 （ 2）整合載體 能 將目標基因整合到宿主的基因組 中 的載體稱為 整合載體 (integration vector), 一般通過同源 重組或轉座因子的轉座特性實現(xiàn)外源基因的整合。 pDG1730是典型的枯草芽孢桿菌整合載體，可將外源基因整合到 ?淀粉酶基因內部。該載體的基本骨架是大腸桿菌的克隆載體和用于革 341 蘭氏陽性細菌的紅霉素抗性選擇標記基因 (erm)；用作整合的元件是中間插入了壯觀霉素抗性基因(spc)的 ?淀粉酶基因，并且其中含有多克隆位點 (圖 163)。 將 目的基因插入到 pDG1730多克隆位點（ BamHI， HindIII或 EcoRI）后，用 ScaI將重組質粒切成線狀，再轉化 枯草芽孢桿菌，通過壯觀霉素進行篩選。只有當載體上的 ?淀粉酶基 因與宿主染色體上 ?淀粉酶基因發(fā)生同源重組， 通過雙交叉置換，目的基因和抗性基因 （ spc） 替換染色體上同源序列之間的區(qū)域，整合到染色體后， 壯觀霉素的抗性才能表現(xiàn)出來。 整合載體 pDG1730的整合是有針對性的，其工作原理也可用于整合其它基因的整合載體的構建，以及用于其它細菌整合載體的構建。 圖 163 整合載體 pDG1730結構示意圖 erm：紅霉素抗性基因； bla：氨芐霉素抗性基因； spc：壯觀霉素抗性基因； amyE’ :?淀粉酶基因上游片段； ’ amyE:?淀粉酶基因下游片段 。 微生物細胞表 面表達系統(tǒng) 微生物細胞表面展示系統(tǒng)的構成包括載體蛋白、目的蛋白和宿主菌株三部分。 位于細胞表面的 342 蛋白都可用于細胞表面展示，常見的載體蛋白包括大腸桿菌的外膜蛋白 (如 OmpA和 OmpC)和與肽聚糖相關的 脂蛋白 (Peptidoglycanassociated lipoprotein， PAL)，假單胞菌 (Pseudomonas spp)的外膜蛋白F(OprF)和 冰核蛋白 INP(Ice Nucleation Protein)， 蠟狀芽孢桿菌群 (Bacillus cereus group)的 S層表面蛋白 (Surface layer protein, Slayer protein)， 葡萄球菌 的表面 蛋白 A(SpA)， 胞外附屬結構 (如鞭毛 )的蛋白等 。為了將目的蛋白展示于微生物細胞表面，還需要構建目的蛋白和外表面蛋白的融合。在大多數細菌表面融合蛋白中，目的蛋白位于融合蛋白的 N端或 C端，有時目的蛋白的短片段也可以在融合蛋白的中間表達 (圖 )。 圖 164 與細菌外膜蛋白在 N端或 C端連接的目的蛋白 (a) 外源蛋白插入到細菌外膜蛋白暴露于表面的環(huán)中； (b)形成融合蛋白； 兩種情況中，外源蛋白或肽段都是位于 細菌細胞的外表面 微生物細胞表面展示技術有著廣泛的用途，可 開發(fā)一些獨特的生物產品如 活疫苗、細胞催化劑、細胞吸附劑、生物傳感器等，還能開發(fā)用于醫(yī)學診斷、工業(yè)、環(huán)境保護等的細胞受體等。 盡管現(xiàn)在已經成功開發(fā)了一些細胞表面展示系統(tǒng)，但是在這一領域里仍有許多問題需要解決。比如利用細胞表面技術開發(fā)細胞催化劑的時候，細胞表面酶的活性與游離酶相比往往降低；在構建細胞表面蛋白庫的時候，有些蛋白的表達量太少以至于難以鑒定；還有空間阻礙、多亞基蛋白的表達、多種外源蛋白的同時表達等問題。因此對細胞表面技術的研究和應用目前只是停 留在實驗室階段，還沒有工業(yè)化。但是隨著細胞表面展示技術、分子生物學技術以及相關的生物技術的發(fā)展，微生物細胞表面展示技術的工業(yè)化應用為時不遠。 第三節(jié) 細菌基因工程的應用 基因工程的實踐主要有三種表現(xiàn)形式，其一是改造細菌使之性狀得到遺傳改良，獲得更好的應用效果，如殺蟲、固氮等，在這種情況下，基因工程的產品仍然是細菌本身。其二是制作生物反應 343 器，利用細菌來生產某種物質。最典型的是大腸桿菌反應器，用來生產多種酶類和多肽（如基因操作中的酶制劑幾乎都是基因工程產品）。其基因工程的產品是產物而不是基因工程菌體本身。還 有一類中間狀態(tài)的類型，即基因工程改造的是細菌本身，但需要的是產物或改造的產物， 通常為了得到某些高表達量的細胞內代謝產物，會對某些細菌進行必要的遺傳學改造，將某些與目標代謝產物合成有關的基因轉入到合適的細菌，這就相當于在宿主菌中重新載入了或加強了某條生理代謝途徑，從而在宿主細菌中得到理想的細胞次級代謝產物， 如通過基因工程改造后提高某種代謝產物的產量或去除了雜質產物，或產生一種新的代謝產物（如鏈霉菌中的新抗生素的合成）等。 現(xiàn)在人們可以將源于微生物、動物、植物甚至源于人類的基因，轉移到諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 等細菌中，獲得了種種具有特殊能力的基因工程細菌。這些基因工程細菌在過去的十幾年內開始大量應用于衛(wèi)生、農業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護等諸多行業(yè)和領域，產生了巨大的經濟效益和社會效益。 在接下來的內容里，將簡單介紹一些重要的基因工程細菌。 一、農業(yè)領域的基因工程細菌 (一 ) 微生物基因工程農藥 目前微生物農藥主要有微生物殺蟲劑、微生物殺菌劑、微生物除草劑及利用微生物代謝分泌的有效活性物質制成的農用抗生素殺蟲、殺菌劑 等 。微生物殺蟲劑中細菌類殺蟲劑以蘇云金芽孢桿菌推廣應用面積最大，而且殺蟲效果非常理想，此外，還有真菌殺蟲劑 、 病毒殺蟲劑等。利用有益微生物及其代謝產物 來 防治作物病蟲害已取得了較為理想的效果 ， 對人畜和生態(tài)環(huán)境十分安全，已成為植物保護發(fā)展的重要方向。 目前農業(yè)上應用的殺蟲基因主要有 三 大類 ， 一類是從細菌中分離出來的細菌殺蟲基因 ,如 蘇云金芽孢桿菌 殺蟲晶體蛋白 (insecticidal crystal protein)基因 ； 另一類是從植物中分離出來的植物抗蟲基因 ， 如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、馬鈴薯蛋白酶抑制劑 Ⅱ 基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。 此外還有其他來源的 蝎毒基因 aaIT、桿狀病毒 egt 基因、白葉枯病菌致病基 因 hrp、抗馬鈴薯晚疫病的 osmotin 基因、病毒增效因子序列、桿狀病毒抗凋亡基因、幾丁質酶基因 等 。 近幾年來， 微生物 基因工程 農藥 的研究十分活躍，并先于抗病蟲 轉基因 植物進入了實用化階段。這一發(fā)展顯示出生物技術用于生防微生物遺傳改良的巨大潛力，并為新一代微生物農藥的進一步研究開發(fā)奠定了基礎。 重組微生物殺蟲劑 —— 蘇云金芽孢桿菌基因工程及應用 蘇云金芽孢桿菌 是目前國內外產量最大、應用范圍最廣的微生物殺蟲劑。 Bt在其生長過程中產生不同類型的殺蟲晶體蛋白（ ICPs）， 主要作用于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等昆 蟲幼蟲以及原生動物門、螨類、扁形動物門等類群。 Bt殺蟲蛋白 對農業(yè)上許多重要作物害蟲具有專一毒殺性，而對 人、哺乳動物以及昆蟲的天敵非常安全。 近年來， 從 Bt 中發(fā)現(xiàn)并正式命名的 ICP 基因已有近 50 大類，總數超過 250 種， 其中 cry1Aa 、 344 cry1Ab 和 cry1Ac 三個基因是殺蟲毒力最高的