【正文】 2. 轉(zhuǎn)錄的有效性 為保證外源基因轉(zhuǎn)錄的有效性，在表達(dá)載體上應(yīng)設(shè)法除去衰減序列 或插入抗轉(zhuǎn)錄終止序列以避免轉(zhuǎn)錄的提前終止，促使 mRNA有效地延伸和終止。也可在終止密碼子后增加終止子序列，使轉(zhuǎn)錄有效終止，并延長 mRNA的半衰期。 3. 翻譯起始的有效性 翻譯起始是多種成分包括 mRNA、 16SrRNA、 fMettRNA，核糖體 S1蛋白、蛋白合成起始因子之間的協(xié)同作用的過程。要使翻譯起始效率最高，要滿足以下條件：①選用最佳起始密碼子 AUG（偶爾為 GUG和 UUG） ； ② SD序列 （ ShineDalgarno sequence） 接 近 或與以下 序 列完全相同 ：5′ ?AG GAGG?3 ′ ； ③ 除 SD序列外 ， 處于起始密碼前的兩個核苷酸應(yīng)該是 A和 U；④ 如果在起始密碼 AUG后的序列是 GCAU或 AAAA序列 ， 能使翻譯效率提高；⑤在翻譯起始區(qū)不能形成明顯的二級結(jié)構(gòu)。 在基因工程中，一般采用 UAA或一連串的終止密碼來有效終止原核細(xì)胞的翻譯。 三、外源基因表達(dá)的方式 1． 外源基因以 融合 蛋白形式表達(dá) 融合表達(dá)是指目標(biāo)基因與 編碼 具有特殊活性的 多肽或蛋白質(zhì)的基因 融合，構(gòu)建成一個融合蛋白基因。用于融合的表達(dá)標(biāo)簽 (tag)蛋白和多肽有 六聚組氨酸肽 (6xHis)和 谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶 (GST)。 利用tag的特性通?？梢詫θ诤系鞍走M(jìn)行親和層析等分離提純， 因此 選擇融合表達(dá) 既 可以保護(hù)外源蛋白不受宿主內(nèi)蛋白酶的降解，同時也大大 簡化 了 重組蛋白的純化 過程 。 2． 構(gòu)建可分泌蛋白 ，分泌到胞外培養(yǎng)基中 通常位于蛋白質(zhì) N 端稱為信號肽 (信號序列，引導(dǎo)肽 )的一段氨基酸序列會幫助蛋白通過細(xì)胞膜。通過基因操作 可在 外源蛋白的 N 端 添加編碼信號肽的 DNA 序列，形成一個分泌蛋白。然而，僅僅是信號肽序列的存在并不能確保高效分泌，并且大腸桿菌和其他革蘭氏陰性細(xì)菌由于外膜的存在，也不能使分泌蛋白進(jìn) 入周圍的培養(yǎng)基。因此可使用革蘭氏陽性細(xì)菌或真核生物細(xì)胞，它們都缺少外膜，能直接分泌蛋白進(jìn)入培養(yǎng)基。另一種辦法是通過遺傳工程將革蘭氏陰性細(xì)菌改造成蛋白質(zhì)分泌型。 3．外源蛋白在宿主細(xì)胞中以包涵體的形式表達(dá) 339 包涵體是致密的不溶性復(fù)合物，含有大部分的表達(dá)蛋白， 可以抵抗宿主細(xì)胞中蛋白水解酶的降解，也便于純化。 一些以可溶性蛋白形式表達(dá)時易被降解的蛋白質(zhì)，以包涵體形式表達(dá)時卻可以很穩(wěn)定。通過超聲波破碎、離心 等 能 較 容易地對之進(jìn)行初級純化。用鹽酸胍或尿素變性溶解包涵體中的蛋白質(zhì)，透析除去變性劑后，蛋白質(zhì)可重新折疊復(fù)性。然而 這種方法 也有缺陷 ，經(jīng)變性 /復(fù)性后正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量不穩(wěn)定，有時會很低，更有些蛋白尤其是 分子量較 大 的 蛋白基本上不能正確進(jìn)行重折疊， 目前研究人員正在努力尋求出一種穩(wěn)定 、 高效表達(dá)的技術(shù) 以 獲得具有天然構(gòu)象和高活性的蛋白質(zhì)。 4. 外源基因在 細(xì)胞表面的表達(dá)（表面展示技術(shù)） 微生物 細(xì)胞表面展示（ cell surface display）技術(shù)是把目的蛋白基因序列 (外源蛋白 )與特定的載體蛋白基因序列 (又叫定位序列 )融合后導(dǎo)入微生物宿主細(xì)胞，從而使目的蛋白表達(dá)并定位于微生物細(xì)胞表面。 四、常見細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌并不一 定是所有外源蛋白表達(dá)的理想微生物。除了大腸桿菌以外，還有許多其他細(xì)菌的表達(dá)系統(tǒng)，但是目前對其他微生物在遺傳和分子生物學(xué)方面的研究程度不及大腸桿菌，幸運的是，適用于大腸桿菌的方法和策略也同樣可以應(yīng)用于其他一些微生物。因此，其他細(xì)菌沒有可專門利用的通用型表達(dá)載體，通常研究者只有在使用它們時才構(gòu)建特異性或?qū)Ｒ恍缘谋磉_(dá)載體。在下面的章節(jié)里，主要介紹幾種比較常見的其他細(xì)菌基因工程表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和特點。 革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體 革蘭氏陰性細(xì)菌通用的表達(dá)載體如 pAV10 等都是在低拷貝數(shù)、廣宿主質(zhì)粒 pRK290 的 多克隆位點中插入來源于轉(zhuǎn)座子 Tn5 末端反向重復(fù)序列的一段 70bp DNA 而構(gòu)建的 (圖 161)。來源于 Tn5 的DNA 克隆片段包含兩個獨立而重疊的啟動子，每一個啟動子分別負(fù)責(zé)一個 Tn5 基因的轉(zhuǎn)錄。 Tn5 能有效地作用于許多細(xì)菌宿主，它的啟動子也能促進(jìn)這些生物的轉(zhuǎn)錄。 在其它革蘭氏 陰性細(xì)菌中所用的表達(dá)載體與此類似，但使用的并不多。 圖 161 克隆載體 pAV10 四環(huán)素抗性基因 (Tetr)；單個 BglII 限制性內(nèi)切酶位點；復(fù)制起點 (ori)；啟動子 (p)；多克隆位點 (MCS)。多克隆序列中插入目 的基因， 340 使基因處于 Tn5 啟動子 (p)的控制之下。箭頭表示轉(zhuǎn)錄的方向。 芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)是一種革蘭氏陽性、無莢膜、能運動的桿狀細(xì)菌 ，無致病性，對人畜無毒，是 革蘭氏陽性細(xì)菌的主要代表 。它 最顯著的特點是在極端生長條件或生命后期在細(xì)胞內(nèi)形成中生芽孢 ， 芽孢具有極強(qiáng)的抗逆境能力。它們不僅是重要的工業(yè)菌種，也是基因表達(dá)研究的有價值材料，具有良好的分泌能力，遺傳背景清楚，生長迅速，培養(yǎng)條件簡便。 下面介紹兩個應(yīng)用于枯草芽孢桿菌的表達(dá)載體。 （ 1） 穿梭型表達(dá)載體 作為 穿梭型表達(dá)載體 (shuttle vector)， 應(yīng)同時具有大腸桿菌載體和枯草芽孢桿菌載體的復(fù)制起點 ， pDG148Stu就 是一個穿梭型表達(dá)載體 （ 圖 162），它利用大腸桿菌 pBR322和枯草芽孢桿菌載體 pVB110的復(fù)制起點 ， 能夠超量表達(dá)插入其 StuI酶切位點的外源蛋白。 pDG148Stu克隆表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)特點：①具有乳糖操縱子調(diào)節(jié)基因 lacI及其調(diào)控序列，使外源蛋白的表達(dá)受 IPTG的調(diào)控。②具有一個雜合啟動子，它來源于乳糖操縱子的表達(dá)調(diào)控區(qū)域和枯草芽孢桿菌 SPO1菌株的啟動子區(qū)域，有利于外源蛋白的高 效合成。③ 3個抗性基因作為篩選標(biāo)記， kan（卡那霉素抗性基因）和 ble(博萊霉素抗性基因）可同時用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抗性篩選， bla（氨芐霉素抗性基因）只能用于大腸桿菌的抗性標(biāo)記。 圖 162 pDG148Stu表達(dá)載體的結(jié)構(gòu) ble：博萊霉素抗性基因； bla：氨芐霉素抗性基因； kan：卡那霉素抗性基因； Pspac：雜合啟動子； lacI：乳糖操縱子阻遏蛋白基因。 （ 2）整合載體 能 將目標(biāo)基因整合到宿主的基因組 中 的載體稱為 整合載體 (integration vector), 一般通過同源 重組或轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座特性實現(xiàn)外源基因的整合。 pDG1730是典型的枯草芽孢桿菌整合載體，可將外源基因整合到 ?淀粉酶基因內(nèi)部。該載體的基本骨架是大腸桿菌的克隆載體和用于革 341 蘭氏陽性細(xì)菌的紅霉素抗性選擇標(biāo)記基因 (erm)；用作整合的元件是中間插入了壯觀霉素抗性基因(spc)的 ?淀粉酶基因，并且其中含有多克隆位點 (圖 163)。 將 目的基因插入到 pDG1730多克隆位點（ BamHI， HindIII或 EcoRI）后，用 ScaI將重組質(zhì)粒切成線狀，再轉(zhuǎn)化 枯草芽孢桿菌，通過壯觀霉素進(jìn)行篩選。只有當(dāng)載體上的 ?淀粉酶基 因與宿主染色體上 ?淀粉酶基因發(fā)生同源重組， 通過雙交叉置換，目的基因和抗性基因 （ spc） 替換染色體上同源序列之間的區(qū)域，整合到染色體后， 壯觀霉素的抗性才能表現(xiàn)出來。 整合載體 pDG1730的整合是有針對性的，其工作原理也可用于整合其它基因的整合載體的構(gòu)建，以及用于其它細(xì)菌整合載體的構(gòu)建。 圖 163 整合載體 pDG1730結(jié)構(gòu)示意圖 erm：紅霉素抗性基因； bla：氨芐霉素抗性基因； spc：壯觀霉素抗性基因； amyE’ :?淀粉酶基因上游片段； ’ amyE:?淀粉酶基因下游片段 。 微生物細(xì)胞表 面表達(dá)系統(tǒng) 微生物細(xì)胞表面展示系統(tǒng)的構(gòu)成包括載體蛋白、目的蛋白和宿主菌株三部分。 位于細(xì)胞表面的 342 蛋白都可用于細(xì)胞表面展示，常見的載體蛋白包括大腸桿菌的外膜蛋白 (如 OmpA和 OmpC)和與肽聚糖相關(guān)的 脂蛋白 (Peptidoglycanassociated lipoprotein， PAL)，假單胞菌 (Pseudomonas spp)的外膜蛋白F(OprF)和 冰核蛋白 INP(Ice Nucleation Protein)， 蠟狀芽孢桿菌群 (Bacillus cereus group)的 S層表面蛋白 (Surface layer protein, Slayer protein)， 葡萄球菌 的表面 蛋白 A(SpA)， 胞外附屬結(jié)構(gòu) (如鞭毛 )的蛋白等 。為了將目的蛋白展示于微生物細(xì)胞表面，還需要構(gòu)建目的蛋白和外表面蛋白的融合。在大多數(shù)細(xì)菌表面融合蛋白中，目的蛋白位于融合蛋白的 N端或 C端，有時目的蛋白的短片段也可以在融合蛋白的中間表達(dá) (圖 )。 圖 164 與細(xì)菌外膜蛋白在 N端或 C端連接的目的蛋白 (a) 外源蛋白插入到細(xì)菌外膜蛋白暴露于表面的環(huán)中； (b)形成融合蛋白； 兩種情況中，外源蛋白或肽段都是位于 細(xì)菌細(xì)胞的外表面 微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)有著廣泛的用途，可 開發(fā)一些獨特的生物產(chǎn)品如 活疫苗、細(xì)胞催化劑、細(xì)胞吸附劑、生物傳感器等，還能開發(fā)用于醫(yī)學(xué)診斷、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等的細(xì)胞受體等。 盡管現(xiàn)在已經(jīng)成功開發(fā)了一些細(xì)胞表面展示系統(tǒng)，但是在這一領(lǐng)域里仍有許多問題需要解決。比如利用細(xì)胞表面技術(shù)開發(fā)細(xì)胞催化劑的時候，細(xì)胞表面酶的活性與游離酶相比往往降低；在構(gòu)建細(xì)胞表面蛋白庫的時候，有些蛋白的表達(dá)量太少以至于難以鑒定；還有空間阻礙、多亞基蛋白的表達(dá)、多種外源蛋白的同時表達(dá)等問題。因此對細(xì)胞表面技術(shù)的研究和應(yīng)用目前只是停 留在實驗室階段，還沒有工業(yè)化。但是隨著細(xì)胞表面展示技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)以及相關(guān)的生物技術(shù)的發(fā)展，微生物細(xì)胞表面展示技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用為時不遠(yuǎn)。 第三節(jié) 細(xì)菌基因工程的應(yīng)用 基因工程的實踐主要有三種表現(xiàn)形式，其一是改造細(xì)菌使之性狀得到遺傳改良，獲得更好的應(yīng)用效果，如殺蟲、固氮等，在這種情況下，基因工程的產(chǎn)品仍然是細(xì)菌本身。其二是制作生物反應(yīng) 343 器，利用細(xì)菌來生產(chǎn)某種物質(zhì)。最典型的是大腸桿菌反應(yīng)器，用來生產(chǎn)多種酶類和多肽（如基因操作中的酶制劑幾乎都是基因工程產(chǎn)品）。其基因工程的產(chǎn)品是產(chǎn)物而不是基因工程菌體本身。還 有一類中間狀態(tài)的類型，即基因工程改造的是細(xì)菌本身，但需要的是產(chǎn)物或改造的產(chǎn)物， 通常為了得到某些高表達(dá)量的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物，會對某些細(xì)菌進(jìn)行必要的遺傳學(xué)改造，將某些與目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成有關(guān)的基因轉(zhuǎn)入到合適的細(xì)菌，這就相當(dāng)于在宿主菌中重新載入了或加強(qiáng)了某條生理代謝途徑，從而在宿主細(xì)菌中得到理想的細(xì)胞次級代謝產(chǎn)物， 如通過基因工程改造后提高某種代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量或去除了雜質(zhì)產(chǎn)物，或產(chǎn)生一種新的代謝產(chǎn)物（如鏈霉菌中的新抗生素的合成）等。 現(xiàn)在人們可以將源于微生物、動物、植物甚至源于人類的基因，轉(zhuǎn)移到諸如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 等細(xì)菌中，獲得了種種具有特殊能力的基因工程細(xì)菌。這些基因工程細(xì)菌在過去的十幾年內(nèi)開始大量應(yīng)用于衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等諸多行業(yè)和領(lǐng)域，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。 在接下來的內(nèi)容里，將簡單介紹一些重要的基因工程細(xì)菌。 一、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的基因工程細(xì)菌 (一 ) 微生物基因工程農(nóng)藥 目前微生物農(nóng)藥主要有微生物殺蟲劑、微生物殺菌劑、微生物除草劑及利用微生物代謝分泌的有效活性物質(zhì)制成的農(nóng)用抗生素殺蟲、殺菌劑 等 。微生物殺蟲劑中細(xì)菌類殺蟲劑以蘇云金芽孢桿菌推廣應(yīng)用面積最大，而且殺蟲效果非常理想，此外，還有真菌殺蟲劑 、 病毒殺蟲劑等。利用有益微生物及其代謝產(chǎn)物 來 防治作物病蟲害已取得了較為理想的效果 ， 對人畜和生態(tài)環(huán)境十分安全，已成為植物保護(hù)發(fā)展的重要方向。 目前農(nóng)業(yè)上應(yīng)用的殺蟲基因主要有 三 大類 ， 一類是從細(xì)菌中分離出來的細(xì)菌殺蟲基因 ,如 蘇云金芽孢桿菌 殺蟲晶體蛋白 (insecticidal crystal protein)基因 ； 另一類是從植物中分離出來的植物抗蟲基因 ， 如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因、馬鈴薯蛋白酶抑制劑 Ⅱ 基因、淀粉酶抑制劑基因、外源凝集素基因等。 此外還有其他來源的 蝎毒基因 aaIT、桿狀病毒 egt 基因、白葉枯病菌致病基 因 hrp、抗馬鈴薯晚疫病的 osmotin 基因、病毒增效因子序列、桿狀病毒抗凋亡基因、幾丁質(zhì)酶基因 等 。 近幾年來， 微生物 基因工程 農(nóng)藥 的研究十分活躍，并先于抗病蟲 轉(zhuǎn)基因 植物進(jìn)入了實用化階段。這一發(fā)展顯示出生物技術(shù)用于生防微生物遺傳改良的巨大潛力，并為新一代微生物農(nóng)藥的進(jìn)一步研究開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。 重組微生物殺蟲劑 —— 蘇云金芽孢桿菌基因工程及應(yīng)用 蘇云金芽孢桿菌 是目前國內(nèi)外產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣的微生物殺蟲劑。 Bt在其生長過程中產(chǎn)生不同類型的殺蟲晶體蛋白（ ICPs）， 主要作用于鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等昆 蟲幼蟲以及原生動物門、螨類、扁形動物門等類群。 Bt殺蟲蛋白 對農(nóng)業(yè)上許多重要作物害蟲具有專一毒殺性，而對 人、哺乳動物以及昆蟲的天敵非常安全。 近年來， 從 Bt 中發(fā)現(xiàn)并正式命名的 ICP 基因已有近 50 大類，總數(shù)超過 250 種， 其中 cry1Aa 、 344 cry1Ab 和 cry1Ac 三個基因是殺蟲毒力最高的