【正文】 上樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。 上樣緩沖液有三個作用 ： 1）增加樣品密度保證 DNA沉入加樣孔內(nèi)； 2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程； 3）其中的染料在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移 。生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳類型 6緩沖液 貯存溫度I % 溴酚藍 4℃% 二甲苯氰 FF40%(m/V) 蔗糖水溶液II % 溴酚藍 室溫% 二甲苯氰 FF15%Ficoll(Type400) 水溶液III % 溴酚藍 4℃% 二甲苯氰 FF30% 甘油水溶液IV % 溴酚藍 4℃40%(m/V) 蔗糖水溶液6 凝膠上樣緩沖液生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳染色 主要有溴化乙錠（ethidium bromide, EB）染色法和 SYBR Gold染色法。 然后，核酸分子在紫外光下發(fā)出熒光，肉眼能看到約 50ngDNA所形成的條帶。生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳染色 凝膠的 EB染色注意事項216。EB被認為是一種強致癌物質(zhì)216。EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸216。EB使用時的配制、貯存及使用EB常用水配制成 10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為 μg/ml216。當要知道 DNA片段準確大小時，凝膠應在無 EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用 EB染色。生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳染色 凝膠 SYBRGold的染色SYBRGold是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強熒光信號。生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳影響電泳遷移的主要因素uDNA的大?。弘p鏈 DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比uDNA的構(gòu)象：一般同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀。u瓊脂糖濃度： 濃度越低，相同核酸分子遷移越快u凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠 ： 溴化乙錠（ EB）插入雙鏈 DNA造成其負電荷減少、剛性和長度增加。生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳影響電泳遷移的主要因素u所用的電壓：低電壓時 DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。u瓊脂糖種類常見的有兩種：標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖；生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖類型 凝結(jié)溫度 /℃ 熔化溫度 /℃標準瓊脂糖 35~38 90~95 不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~42 85~90高強度瓊脂糖 34~43 85~95修飾的低熔點 /凝點瓊脂糖25~35 63~6535 65超低熔點 8~15 40~45低黏性低熔點瓊脂糖 25~30 7038 8530 75不同類型瓊脂糖的性質(zhì)生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳濃 度（% ）標 準(kb)高強度(kb)低熔點(kb)低黏度低溶點(kb) 1~50 ~25 ~15 ~10 ~10 ~12 ~8 ~8 ~6 ~7 ~7 ~4 ~4 ~4 ~3 ~3 ~1 ~1 ~ ~不同類型瓊脂糖分離 DNA片段的范圍生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳影響電泳遷移的主要因素u電泳緩沖液： 常用的有 TAE、 TPE及 TBE三者相比：1） TAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2） TBE和 TPE比 TAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3） 雙鏈線狀 DNA片段在 TAE中比在 TBE或 TPE中遷移快 10% ；4） 對于高分子質(zhì)量的 DNA， TAE的分辨率略高于 TBE或 TPE，對于低分子質(zhì)量的 DNA， TAE要差些。超螺旋DNA在 TAE中的電泳分辨率要好于 TBE。生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳影響電泳遷移的主要因素不同構(gòu)像質(zhì)粒生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳紫外線光源靈敏度 :302nm254nm366nm生命科學學院一、瓊脂糖凝膠電泳生命科學學院二、瓊脂糖變性膠電泳 生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和 N， N′甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，這兩種成分在有引發(fā)劑和增速劑存在的情況下，丙烯酰胺的單體形成長鏈，由 N， N′甲叉雙丙烯酰胺的雙功能基團和鏈末端的自由功能基團反應而發(fā)生交聯(lián)。 丙烯酰胺為白色結(jié)晶粉末，無味，分子量為 ，為中樞神經(jīng)毒物。 N， N’甲叉雙丙烯酰胺也為白色結(jié)晶粉末，無味，分子量為，亦為中樞神經(jīng)毒物。 1% 的稀溶液與皮膚接觸也會引起皮膚發(fā)炎，小鼠的確切致死量（ LD50）為 170mg/㎏ ，所以在實驗室操作時應盡量避免與之直接接觸和吸入粉塵。 聚丙烯酰胺凝膠中常用的引發(fā)劑過硫酸銨和核黃素在堿性條件下可產(chǎn)生自由基，而增速劑 N， N， N′， N′四甲基乙二銨（ TEMED）可催化由過硫酸銨產(chǎn)生的自由基的形成，從而加速聚合。生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳種類變性聚丙烯酰胺凝膠： 用于單鏈 DNA片段的分離或純化。變性的 DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。用途：放射性 DNA探針的分離、 DNA測序反應等。非變性聚丙烯酰胺凝膠： 用于雙鏈 DNA片段的分離和純化。注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。用途：制備高純度的 DNA片段。生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳丙烯酰胺濃度（ % ）有效分離范圍（ bp）二甲苯氰 FF 溴酚藍 1000~2023 460 100 80~500 260 65 60~400 160 45 40~200 70 20 25~150 60 15 6~100 45 12注 :N,N`亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的 1/30。DNA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳SSCPSNPDNA測序蛋白質(zhì)分離175 kD 83 65 45 17聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳　聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳分離蛋白質(zhì) (補充）　 2D Gel Electrophoresis第一向IEF:IsoelectricFocusing等電聚焦區(qū)分帶不同電荷的分子生命科學學院三、聚丙烯酰胺凝膠電泳　聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳分離蛋白質(zhì) (補充）第二向： SDSPAGE分離不同分子量蛋白質(zhì)生命科學學院四、脈沖電場凝膠電泳 pulsedfieldgelelectrophoresis， PFGE為何選 PFGE？超過一定大小的線狀雙鏈 DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度（ 40kb）后 DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，而主要決定于電場強度。但 PEGE解決了這一問題。生命科學學院四、脈沖電場凝膠電泳PFGE工作的基本原理這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的。 DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決于它的大小。該法可分離長至 5Mb的 DNA分子。嚴格說來，應叫交替電場凝膠電泳。生命科學學院四、脈沖電場凝膠電泳B+A+AB脈沖電場電泳示意圖生命科學學院四、脈沖電場凝膠電泳 PEGE類型垂直脈沖場電泳系統(tǒng) (verticalpulsedfield)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng) (fieldinversion)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng) (rotatinggel)箝位勻強電場系統(tǒng) (contourclampedhomogeneouselectricfield)生命科學學院四、脈沖電場凝膠電泳A+AB+B垂直或橫向交變系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng) 旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A+AB+BA+AB+B+生命科學學院四、脈沖電場凝膠電泳影響分辨率的因素u脈沖時間（ )：增加脈沖時間分離較大分子，減少脈沖時間分離較小分子。u電壓：若固定脈沖時間，增加電場強度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場強度會導致較小片段泳動的紊亂。u電場夾角：電場方向的夾角常為 1100 1200，研究證實900夾角也非常有效的。u溫度：標準瓊脂糖電泳基本在室溫進行， PFGE一般應在4℃ 進行。較高的溫度 DNA泳動較快；但是較高的溫度也引起較小片段的泳動截留和明顯的條帶變寬。生命科學學院四、脈沖電場凝膠電泳A+AB+B垂直或橫向交變系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng) 旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A+AB+BA+AB+B+生命科學學院五、凝膠電泳中 DNA的檢測