【文章內(nèi)容簡介】 冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入 1/10體積的 NaAc（ ， 3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用 70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干 DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用 TE緩沖液溶解TE中的 EDTA能螯和 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNasepH值為 ，可防止 DNA發(fā)生酸解 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取生命科學(xué)學(xué)院一、 DNA提取的基本原理與方法DNA提取常見問題u DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)u DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)u DNA中殘留有金屬離子u 重新純化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）u 重新沉淀 DNA，讓酒精充分揮發(fā)u 增加 70％乙醇洗滌的次數(shù)（ 23次）問題 1： DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和 PCR反應(yīng)。 原因?qū)Σ呱茖W(xué)學(xué)院一、 DNA提取的基本原理與方法DNA提取常見問題216。 材料不新鮮或反復(fù)凍融216。 未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性216。 提取過程操作過于劇烈， DNA被機(jī)械打斷216。 外源核酸酶污染216。 反復(fù)凍融216。 盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融216。 液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液216。 在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的 DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量216。 細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔216。 所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌216。 將 DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融問題 2： DNA降解。對策原因生命科學(xué)學(xué)院一、 DNA提取的基本原理與方法DNA提取常見問題216。 實(shí)驗(yàn)材料不佳或量少216。 破壁或裂解不充分216。 沉淀不完全216。 洗滌時 DNA丟失216。 盡量選用新鮮（幼嫩）的材料216。 動植物要勻漿研磨充分； G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁216。 高溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細(xì)胞、細(xì)菌可增加 PK的用量）216。 低溫沉淀，延長沉淀時間216。 加輔助物，促進(jìn)沉淀216。 洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問題 3： DNA提取量少。對策原因生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法制備 RNA的關(guān)鍵 — 防止內(nèi)外源 RNase的作用1)RNase的特點(diǎn) ：抗酸抗堿 ,具很廣 pH作用范圍 ?？垢邷貒?yán)寒 (0~65℃ 均具活性）；抗變性劑2)解決辦法 ：外源 RNase— 高溫，焦磷酸二乙酯 (DEPC)處理所有溶液（ TrisHCl除外）和器皿，操作者帶手套內(nèi)源 RNase— 高溫抽提，強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑， RNase抑制劑，蛋白酶 K等生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法總 RNA的提取根據(jù)所用蛋白質(zhì)變性劑種類不一樣分為以下三種制備方法：1）熱苯酚抽提法2）胍鹽法：異硫氰酸胍和硫氰酸胍3） LiCl/尿素法其中以胍鹽法最好，對于從那些 RNase含量很高的組織（胰臟）中提取 RNA特別有效，可使 RNase迅速變性，制備的 RNA有較高翻譯活性。在 RNA制備中，細(xì)胞破碎與蛋白質(zhì)變性是同步進(jìn)行的。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法 RNA提取的通用方法 異 硫氰酸胍 /苯酚法原理：n細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；n釋放出來的 DNA和 RNA由于在特定 pH下溶解度的不同而分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離；n有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈 RNA。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RNA提取的通用方法 異 硫氰酸胍 /苯酚法步驟 :n材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。n裂解變性 ： 異硫氰酸胍 （ 亞硫氫胍，巰基乙醇， N月桂肌氨酸等）。使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放 RNA，有效抑制核酸酶。n純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚 /氯仿可抽提去除雜物。n洗滌： 70％乙醇。n沉淀：異丙醇、無水乙醇。n乙酸鈉（ ）：維持變性的細(xì)胞裂解液的 pH值，沉淀 RNA。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀 RNA。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法影響 RNA提取的因素材料：n新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料n如若材料來源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在 TRIzol或樣品貯存液中，于－70℃ 或－ 20℃ 保存n如要多次提取，請分成多份保存n液氮長期保存，－ 70℃ 短期保存生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法影響 RNA提取的因素樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：u培養(yǎng)細(xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀鈛酵母和細(xì)菌：一般 TRIzol可直接裂解，對于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁u動植物組織： 先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動作快速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解為減少 DNA污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法影響 RNA提取的因素純化：在使用氯仿抽提純化時，一定要充分混勻，且動作快速；經(jīng)典的純化方法，如 LiCl沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時間長，易造成 RNA降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 RNA后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RNA提取常見問題216。RNA的降解 216。OD260/OD280比值偏低216。電泳帶型異常216。下游實(shí)驗(yàn)效果不佳生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RNA提取常見問題RNA的降解 新鮮細(xì)胞或組織： 裂解液的質(zhì)量 外源 RNase的污染 裂解液的用量不足 組織裂解不充分 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 (如脾臟，胸腺等 )，很難避免 RNA 的降解。 建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時使用更多裂解液 。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RNA提取常見問題RNA的降解 冷凍樣品： 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至 70℃ 冰箱保存。樣品要相對小一點(diǎn)； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過程中及時補(bǔ)充液氮。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RNA提取常見問題OD260/OD280比值偏低蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法 :重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。解決辦法 :重新抽提一次，再沉淀，溶解 。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RNA提取常見問題OD260/OD280比值偏低 抽提試劑殘留： 確保洗滌時要徹底懸浮 RNA，并且徹底去掉 75% 乙醇。 解決辦法 :再沉淀一次后，溶解。 設(shè)備限制： 測定 OD260及 OD280 數(shù)值時，要使 OD260 讀數(shù)在 。此范圍線性最好。 用水稀釋樣品： 測 OD 時，對照及樣品稀釋液請使用 10 mM Tris， pH 。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RNA提取常見問題電泳帶型異常非變性電泳 ：上樣量超過 3ug，電壓超過 6V/cm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致 28S和 18S條帶分不開。變性電泳條帶變淡 ： EB與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；甲醛的質(zhì)量不高 。生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RNA提取常見問題 下游實(shí)驗(yàn)效果不佳RNA降解 抽提試劑的殘留 75% 乙醇洗滌 樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 DNA污染 使用 RNaseFree的 DNaseI消化抽提 RNA生命科學(xué)學(xué)院二、 RNA提取的基本原理與方法RT常見問題分析和解決方案可能原因 解決方案RNA降解 分離無污染，高質(zhì)量的 RNA；防止 RNA降解RNA中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑 70％（ v/v）