基因工程第四章工具酶(文件)
【正文】 命名原則： Hin d III Haemphilus influenzae 嗜血流桿菌 D菌株 第三個酶 Eco R I Escherichia coli 大腸桿菌 R菌株 第一個酶 四、影響酶活性的因素： 靶 DNA的純度：內(nèi)切酶的消化底物的速率很大程度上取決于使用的 DNA樣品本身的純度。 ?消除辦法： 盡量保證 DNA純度達到最大。如果加入酶量過大，甘油濃度過高，會抑制酶活性。 DNA的甲基化程度： 核酸內(nèi)切酶是原核生物限制修飾的組成部分，因此，識別序列中特定核苷酸的甲基化作用，會強烈的影響酶的活性，造成 DNA只能被局部消化。 4. DNA的分子結(jié)構(gòu)： ?DNA分子的結(jié)構(gòu)有很多種，以質(zhì)粒 DNA為例，他有三種存在方式，超螺旋、環(huán)狀帶切刻、線性。 內(nèi)切酶的緩沖液：不同的酶使用不同的類型 ?Buffer 鹽： Mgcl,Nacl,Kcl提供離子環(huán)境。有效防止二硫鍵形成。 五、雙酶切： ?沒有不同的 buffer :A /B/ H/ M/ 擇兩個酶通用的緩沖液 Ligases Section two DNA連接酶： ? DNA被限制性內(nèi)切酶消化后，單憑粘性末端是不能彼此牢固的連接在一起的，需要進行連接處理，這樣我們用到了 DNA連接酶。連接酶的來源有兩種，一種是大腸桿菌染色體編碼的 DNA連接酶；另一種是大腸桿菌 T4噬菌編碼的叫 T4連接酶，這種酶容易制備，直接從感染T4大腸桿菌的菌體中分離純化，而且他可以連接兩條平末端的 DNA片斷 ? DNA連接酶只能連接 DNA雙螺旋骨架上的切刻，而不能連接封閉缺口。連接反應(yīng)可以是 4℃ 連接 24小時，或 15℃ 過夜（注意參照說明書）。 53外切酶活性 : 35外切酶活性：防止錯配。 ?作用：可對 3‘隱藏性末端進行修補，尤其是被內(nèi)切酶消化后標記 DNA片斷的末端； cDNA合成中催化第二條鏈的合成（ DNA聚合酶 I也可，但安全性差，可能會將原鏈切割。由于 DNA聚合酶 I具有 5－ 3外切酶活性，切下后，聚合酶活性表現(xiàn)出來，又加上一個新的堿基可使切刻由 5－ 3的方向移動，加上的dNTP用 P標記，這樣換上的新鏈上就有了放射性標記。 polymerase Section three ?DNA聚合酶 ?DNA
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