何水林版基因工程第五章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定-資料下載頁
2024-09-20 20:33本頁面
【正文】 半乳糖苷酶 Xgal 半乳糖 5溴 4氯靛藍(lán) + 深藍(lán)色 ?半乳糖苷酶使 Xgal分解成藍(lán)色產(chǎn)物。 利用插入的外源基因的 表達(dá)產(chǎn)物 特性進(jìn)行直接選擇。 轉(zhuǎn)化進(jìn)來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。 二、根據(jù)插入基因的表型選擇 1. 彌補(bǔ)缺陷 his his+ 受體菌： 外源基因： 在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長 例：抗生素抗性 抗性基因 載體 外源 DNA 連接 轉(zhuǎn)化 受體菌 抗生素培養(yǎng)基平板 含抗生素抗性基因的 克隆才能生長 使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。 2. 增加新性狀 有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。 1. 直接電泳檢測法 從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。 三、 DNA電泳檢測法 Marker 載體 重組克隆 2. 酶切電泳篩選法 根據(jù)外源 DNA序列的限制性酶切圖譜，選一兩種內(nèi)切酶切割，電泳后比較電泳結(jié)果： DNA帶數(shù)和長度。 一般用重組時(shí)的內(nèi)切酶將外源 DNA切出 單 雙 四、 PCR擴(kuò)增檢測法 應(yīng)用 PCR反應(yīng)擴(kuò)增出預(yù)期 DNA片斷 （ 1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或 DNA）； （ 2）用外源 DNA插入片斷引物作 PCR； （ 3）凝膠電泳； （ 4）是否有條帶產(chǎn)生，條帶大小是否正確。 五、核酸雜交檢測法 1. Southern blotting 從宿主細(xì)胞中提取DNA， 用探針雜交 。 2. Northern blotting 主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。 從宿主細(xì)胞中提取RNA， 用探針雜交 。 3. Western blotting 在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后 ， 用 轉(zhuǎn)膜和免疫 的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶 。 ①（ SDSPAGE） 點(diǎn)樣 電泳方向 膜 膠 蛋白 ② 轉(zhuǎn)膜 ③ 雜交 待測蛋白 硝酸纖 維素膜 一抗 二抗 ④ 檢測 3. Western blotting 4. 原位雜交篩選 利用抗體作為“ 探針 ” ， 檢測產(chǎn)生外源 DNA編碼的抗原的菌落或噬菌斑 。 六、免疫化學(xué)檢測法 對表達(dá)產(chǎn)物的檢測。 蛋白－蛋白“雜交” 放射性抗體檢測 與菌落雜交相似 DNA測序是最為準(zhǔn)確的重組子鑒定方法 ，可以鑒定重組克隆序列是否準(zhǔn)確無誤 。 七、 DNA序列分析 （ 1）大腸桿菌的 βD葡萄糖醛酸糖苷酶 （ βDglucuronidase， GUS）； （ 2）細(xì)菌和螢火蟲的 熒光素酶 （ Luciferase）； （ 3）水母綠色熒光蛋白（ GFP）基因 （ Green Fluorescent Protein）。 植物轉(zhuǎn)化體報(bào)告基因（ reporter gene)篩選 報(bào)告基因： 基因載體上引入的一些可證明載體已經(jīng)進(jìn)入宿主細(xì)胞 ， 并可將含有目的基因的宿主細(xì)胞從其他細(xì)胞中識別區(qū)分甚至挑選出來的具有特殊標(biāo)志意義的基因 。 （ 1） 獲得目的基因 ； （ 2）目的基因與載體的酶切與連接； （ 3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞； （ 4）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的大量繁殖； （ 5）目的基因的檢測和表達(dá)。 進(jìn)行基因工程操作的一般步驟 ? 什么是感受態(tài)細(xì)胞 ？ 簡述 CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化 DNA的原理 ？ 什么是 Ti質(zhì)粒 ？ 簡述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti質(zhì)粒遺傳轉(zhuǎn)化方法 。 重組子篩選主要有哪些方法 ？ 思 考 題
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