何水林版基因工程第五章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定(文件)
【正文】 保證電擊過程中細胞不被擊穿而死亡 。 DNA ?m鎢彈頭 吸附 金屬微粒加速，進入受體細胞 基因槍 裝入 2. 基因槍法（ gene gun） 外植體制備 轟擊 外植體培養(yǎng)及選擇 具體操作 1. DNA微彈的制備 2. 外植體的制備 3. DNA微彈轟擊 4. 外植體的培養(yǎng) 植物細胞 原生質(zhì)體 纖維素酶和果膠酶 DNA 混合入 電擊緩沖液 電擊處理 愈傷組織 幼苗 分化 3. 電擊法（電穿孔法） 選擇培養(yǎng) 二、重組 DNA導入真核細胞 （一）導入酵母細胞 1. 磷酸鈣沉淀法 2. 脂質(zhì)體介導法 3. 顯微注射法 4. DEAE葡萄糖轉(zhuǎn)染法 （二）導入植物細胞 （三）導入動物細胞 原理： （三）導入動物細胞 1. 磷酸鈣沉淀法 通過磷酸鈣 DNA共沉淀 ， 將外源基因?qū)氩溉閯游锛毎? 依據(jù)不同的細胞類型，平皿上最多能有 10%的細胞能吸收 DNA沉淀。 3. 顯微注射法 1）外源基因制備：線性化的質(zhì)粒或目的片段 2）收集受精卵：受孕后幾小時內(nèi) 3）顯微注射：將外源基因注入受精卵的 雄原核 4）受精卵移植 二乙氨乙基（ DEAE）葡聚糖為多聚陽離子試劑，能促進哺乳動物細胞攝入外源 DNA。 向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入 900μl培養(yǎng)液 ， 讓細菌恢復一小段時間 ， 取 100μl鋪板 。 Ampr上有插入位點 Pst I。 二、根據(jù)插入基因的表型選擇 1. 彌補缺陷 his his+ 受體菌： 外源基因： 在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長 例：抗生素抗性 抗性基因 載體 外源 DNA 連接 轉(zhuǎn)化 受體菌 抗生素培養(yǎng)基平板 含抗生素抗性基因的 克隆才能生長 使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。 一般用重組時的內(nèi)切酶將外源 DNA切出 單 雙 四、 PCR擴增檢測法 應(yīng)用 PCR反應(yīng)擴增出預(yù)期 DNA片斷 （ 1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或 DNA）； （ 2）用外源 DNA插入片斷引物作 PCR； （ 3）凝膠電泳； （ 4）是否有條帶產(chǎn)生，條帶大小是否正確。 3. Western blotting 在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后 ， 用 轉(zhuǎn)膜和免疫 的方法檢測膠上的蛋白質(zhì)泳帶 。 七、 DNA序列分析 （ 1）大腸桿菌的 βD葡萄糖醛酸糖苷酶 （ βDglucuronidase， GUS）； （ 2）細菌和螢火蟲的 熒光素酶 （ Luciferase）； （ 3）水母綠色熒光蛋白（ GFP）基因 （ Green Fluorescent Protein）。 重組子篩選主要有哪些方法 ？ 思 考 題 。 （ 1） 獲得目的基因 ； （ 2）目的基因與載體的酶切與連接； （ 3）將目的基因?qū)胧荏w細胞； （ 4）轉(zhuǎn)化受體細胞的大量繁殖； （ 5）目的基因的檢測和表達。 六、免疫化學檢測法 對表達產(chǎn)物的檢測。 2. Northern blotting 主要檢測插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。 1. 直接電泳檢測法 從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。 利用插入的外源基因的 表達產(chǎn)物 特性進行直接選擇。 1）載體 DNA類型、大?。恢亟M DNA濃度、純度 2）受體細胞 3）轉(zhuǎn)化方法：同一轉(zhuǎn)化方法 技術(shù)參數(shù) 影響轉(zhuǎn)化率 （二）轉(zhuǎn)化率的影響因素 三、轉(zhuǎn)化率及影響因素 一
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