何水林版基因工程第五章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定(文件)
【正文】 保證電擊過(guò)程中細(xì)胞不被擊穿而死亡 。 DNA ?m鎢彈頭 吸附 金屬微粒加速，進(jìn)入受體細(xì)胞 基因槍 裝入 2. 基因槍法（ gene gun） 外植體制備 轟擊 外植體培養(yǎng)及選擇 具體操作 1. DNA微彈的制備 2. 外植體的制備 3. DNA微彈轟擊 4. 外植體的培養(yǎng) 植物細(xì)胞 原生質(zhì)體 纖維素酶和果膠酶 DNA 混合入 電擊緩沖液 電擊處理 愈傷組織 幼苗 分化 3. 電擊法（電穿孔法） 選擇培養(yǎng) 二、重組 DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞 （一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞 1. 磷酸鈣沉淀法 2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 3. 顯微注射法 4. DEAE葡萄糖轉(zhuǎn)染法 （二）導(dǎo)入植物細(xì)胞 （三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞 原理： （三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞 1. 磷酸鈣沉淀法 通過(guò)磷酸鈣 DNA共沉淀 ， 將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞 依據(jù)不同的細(xì)胞類(lèi)型，平皿上最多能有 10%的細(xì)胞能吸收 DNA沉淀。 3. 顯微注射法 1）外源基因制備：線(xiàn)性化的質(zhì)粒或目的片段 2）收集受精卵：受孕后幾小時(shí)內(nèi) 3）顯微注射：將外源基因注入受精卵的 雄原核 4）受精卵移植 二乙氨乙基（ DEAE）葡聚糖為多聚陽(yáng)離子試劑，能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入外源 DNA。 向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入 900μl培養(yǎng)液 ， 讓細(xì)菌恢復(fù)一小段時(shí)間 ， 取 100μl鋪板 。 Ampr上有插入位點(diǎn) Pst I。 二、根據(jù)插入基因的表型選擇 1. 彌補(bǔ)缺陷 his his+ 受體菌： 外源基因： 在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 例：抗生素抗性 抗性基因 載體 外源 DNA 連接 轉(zhuǎn)化 受體菌 抗生素培養(yǎng)基平板 含抗生素抗性基因的 克隆才能生長(zhǎng) 使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。 一般用重組時(shí)的內(nèi)切酶將外源 DNA切出 單 雙 四、 PCR擴(kuò)增檢測(cè)法 應(yīng)用 PCR反應(yīng)擴(kuò)增出預(yù)期 DNA片斷 （ 1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或 DNA）； （ 2）用外源 DNA插入片斷引物作 PCR； （ 3）凝膠電泳； （ 4）是否有條帶產(chǎn)生，條帶大小是否正確。 3. Western blotting 在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后 ， 用 轉(zhuǎn)膜和免疫 的方法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶 。 七、 DNA序列分析 （ 1）大腸桿菌的 βD葡萄糖醛酸糖苷酶 （ βDglucuronidase， GUS）； （ 2）細(xì)菌和螢火蟲(chóng)的 熒光素酶 （ Luciferase）； （ 3）水母綠色熒光蛋白（ GFP）基因 （ Green Fluorescent Protein）。 重組子篩選主要有哪些方法 ？ 思 考 題 。 （ 1） 獲得目的基因 ； （ 2）目的基因與載體的酶切與連接； （ 3）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞； （ 4）轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的大量繁殖； （ 5）目的基因的檢測(cè)和表達(dá)。 六、免疫化學(xué)檢測(cè)法 對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。 2. Northern blotting 主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。 1. 直接電泳檢測(cè)法 從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。 利用插入的外源基因的 表達(dá)產(chǎn)物 特性進(jìn)行直接選擇。 1）載體 DNA類(lèi)型、大??；重組 DNA濃度、純度 2）受體細(xì)胞 3）轉(zhuǎn)化方法：同一轉(zhuǎn)化方法 技術(shù)參數(shù) 影響轉(zhuǎn)化率 （二）轉(zhuǎn)化率的影響因素 三、轉(zhuǎn)化率及影響因素 一
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