何水林版基因工程第五章基因的轉(zhuǎn)移與重組體的篩選和鑒定(存儲(chǔ)版)
【正文】 的方法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶 。 二、根據(jù)插入基因的表型選擇 1. 彌補(bǔ)缺陷 his his+ 受體菌： 外源基因： 在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 例：抗生素抗性 抗性基因 載體 外源 DNA 連接 轉(zhuǎn)化 受體菌 抗生素培養(yǎng)基平板 含抗生素抗性基因的 克隆才能生長(zhǎng) 使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。 向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入 900μl培養(yǎng)液 ， 讓細(xì)菌恢復(fù)一小段時(shí)間 ， 取 100μl鋪板 。 DNA ?m鎢彈頭 吸附 金屬微粒加速，進(jìn)入受體細(xì)胞 基因槍 裝入 2. 基因槍法（ gene gun） 外植體制備 轟擊 外植體培養(yǎng)及選擇 具體操作 1. DNA微彈的制備 2. 外植體的制備 3. DNA微彈轟擊 4. 外植體的培養(yǎng) 植物細(xì)胞 原生質(zhì)體 纖維素酶和果膠酶 DNA 混合入 電擊緩沖液 電擊處理 愈傷組織 幼苗 分化 3. 電擊法（電穿孔法） 選擇培養(yǎng) 二、重組 DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞 （一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞 1. 磷酸鈣沉淀法 2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法 3. 顯微注射法 4. DEAE葡萄糖轉(zhuǎn)染法 （二）導(dǎo)入植物細(xì)胞 （三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞 原理： （三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞 1. 磷酸鈣沉淀法 通過磷酸鈣 DNA共沉淀 ， 將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞 依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有 10%的細(xì)胞能吸收 DNA沉淀。 （三）轉(zhuǎn)染（ transfection） 受體菌直接捕獲 噬菌體 DNA的過程。 ② 加尾－堿基互補(bǔ) ④ 缺點(diǎn)： ③ 優(yōu)點(diǎn)： 能把任何片段連接起來 操作繁瑣； 外源片段難以回收 ； 同聚物尾巴影響外源基因表達(dá)。 ① 原理： 分別給載體和插入片斷加上 互補(bǔ)的 核苷酸。 入門克隆 改造過的各種表達(dá)載體 三、 Gateway 載體構(gòu)建系統(tǒng) （ 1）創(chuàng)建入門克隆 BP反應(yīng)： attB+attP attL+attR，產(chǎn)物：入門克隆 入門克隆 改造過的各種表達(dá)載體 √ 三、 Gateway 載體構(gòu)建系統(tǒng) （ 2）構(gòu)建表達(dá)克隆 LR反應(yīng)： attL+attR attB+attP，產(chǎn)物：表達(dá)克隆 入門克隆 改造過的各種表達(dá)載體 √ √ 第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞 一、重組 DNA導(dǎo)入大腸桿菌 （一）轉(zhuǎn)化（ transformation） 大腸桿菌捕獲 質(zhì)粒 DNA的過程。 每 ?g ?DNA能形成 106個(gè)噬菌斑 現(xiàn)在把 DNA轉(zhuǎn)移至動(dòng)物細(xì)胞的過程也稱轉(zhuǎn)染 體外包裝過程 二、重組 DNA導(dǎo)入真核細(xì)胞 （一）導(dǎo)入酵母細(xì)胞 1. 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 2. 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化 3. PEG1000轉(zhuǎn)化法 4. 電擊法 （二）導(dǎo)入植物細(xì)胞 （三）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞 1. 利用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化 酵母 原生質(zhì)體 感受態(tài) 酶去壁 CaCl2 PEG 插入外源基因的載體 共轉(zhuǎn)化： 將兩個(gè)以上的基因同時(shí)導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞的方法 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化細(xì)胞達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的 1%~2%，轉(zhuǎn)化率受再生率影響 共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體占轉(zhuǎn)化子總數(shù)的 25%~33% 酵母 2. 堿金屬離子介導(dǎo)的完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化 插入外源基因的載體 40% PEG 4000 熱激 涂布選擇性平板，篩選轉(zhuǎn)化子 吸收線性 DNA能力明顯大于環(huán)狀 DNA，兩者相差
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