基因工程第五章載體-閱讀頁
2024-09-30 20:46本頁面
【正文】 與阻遏蛋白結(jié)合，阻遏蛋白與操作子脫離）。 啟動(dòng)子的可控性啟動(dòng)子的可控性PP乳糖啟動(dòng)子 Pl a c的可控性：乳糖啟動(dòng)子 P l a c 的可控性：OOPP OO高效轉(zhuǎn)錄高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白阻遏蛋白誘導(dǎo)誘導(dǎo)乳糖 異丙基 ? D 硫代半乳糖苷（ I P T G ）乳糖 異丙基 ? D 硫代半乳糖苷（ I P T G ）野生型的 Pla c與其控制區(qū) Olac野生型的 Pla c與其控制區(qū) Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基存在時(shí)，整個(gè)操縱子處于基底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動(dòng)子 Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅啟動(dòng)子 P lac 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高提高?構(gòu)建可對(duì)重組克隆進(jìn)行選擇的質(zhì)粒載體，這種質(zhì)粒載體具有直接選擇標(biāo)記并可賦予寄主細(xì)胞相應(yīng)的表型（熒光蛋白）。 四、典型的質(zhì)粒載體 1. pBR322： pBR322是按照標(biāo)準(zhǔn)的載體命名原則命名， p表示質(zhì)粒 plasmid， BR分別是質(zhì)粒的兩位構(gòu)建人 bolivar和 rodriguez, 322指實(shí)驗(yàn)室編號(hào)。 ? 有兩種抗生素抗性基因，可作為轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記。 ?具有較高的拷貝數(shù)，我們用氯霉素（壯觀霉素）處理后，質(zhì)粒的個(gè)數(shù)可達(dá) 1000個(gè)。 pUC質(zhì)粒載體： ?pUC質(zhì)粒載體：是由美國加利福尼亞大學(xué)的專家構(gòu)建的。 最常用的克隆載體，優(yōu)點(diǎn)： ?具有更小的相對(duì)分子量和更高的拷貝數(shù)。 ?適合組織化學(xué)法檢測重組子。 表達(dá)載體： 穿梭質(zhì)粒載體： ?指的是一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起始位點(diǎn)和選擇標(biāo)記可在兩種不同的寄主中存活和復(fù)制，并可攜帶外源基因在不同物種的細(xì)胞之間往返穿梭的質(zhì)粒載體。 ?目前像大腸桿菌－枯草芽孢的穿梭質(zhì)粒，大腸－釀酒酵母，大腸－動(dòng)物等。 ? 對(duì)于天然質(zhì)粒來說，他們的基因中含有控制質(zhì)粒分配的功能區(qū)，細(xì)胞分裂構(gòu)成中，這個(gè)功能區(qū)保證質(zhì)?？截惐黄骄峙洹? 解決辦法：施加選擇性壓力（抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)）。這些因素會(huì)引起質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。 ??噬菌體載體和外源基因重組后，可以隨寄主細(xì)胞一道復(fù)制和增值，在溶源周期，可整合到宿主染色體上，這是 ?噬菌體載體作為基因工程載體的以發(fā)展重要特征。 ?環(huán)化狀態(tài)下， ?噬菌體 DNA分子的長度是 48502bp, 定位著 61個(gè)與噬菌體生活相關(guān)的基因，這些基因聚集成促，控制著噬菌體頭、維、復(fù)制、重組四大功能。所以我們要對(duì)它進(jìn)行改造，改造可通過點(diǎn)突變，序列置換及缺失。而另一部分基因當(dāng)他們被外源基因取代后，并不影響噬菌體的生命功能。 ? ?噬菌體載體有一個(gè)系列，分別可容納 9－ 22kb的片斷。 三、 ?噬菌體載體的作用： ? ?噬菌體侵染宿主后，有兩個(gè)途徑： 溶源途徑：當(dāng) DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，整合到染色體上，隨著宿主染色體復(fù)制而復(fù)制。然后切割，包裝、釋放。 ? 我們可以以噬菌體 DNA作為載體，通過外源基因體外重組、病毒的體外包裝（有試劑盒），制造出成熟的含有外源基因的病毒顆粒，去感染大腸桿菌，發(fā)生溶源性結(jié)合，然后通過大腸桿菌的增殖使含有外源基因的大腸桿菌的數(shù)量不斷增加，同時(shí)采用選擇性壓力富集含有外源基因的菌株，（可不講 :最后通過特殊條件誘導(dǎo)，溶源途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱呀馔緩?，噬菌體大量繁殖，產(chǎn)生噬菌斑，通過雜交進(jìn)行目的基因檢測
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