【正文】 結(jié)構(gòu)和活性： 酶類別 肽鏈 5’3’聚合活性 RNAseH AMV α62， 000 β94， 000 + +++ MMLV 84， 000 + + 生命科學(xué)學(xué)院 第三節(jié) DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶 五、逆轉(zhuǎn)錄酶（ reverse transcriptase） 用途： (1) 5’ → 3’ 聚合酶活性 , 能以 RNA或 DNA模板合成 DNA分子； (2) RNA酶 H活性：對 RNA:DNA雜交體中的 RNA特異性地降解，免除了在反轉(zhuǎn)錄完成后再用 NaOH降解 RNA模板的步驟。它作用的底物可以是具有 3’OH末端的單鏈DNA， 也可以是具有 3’OH突出末端的雙鏈 DNA。 生命科學(xué)學(xué)院 第四節(jié) DNA修飾酶 生命科學(xué)學(xué)院 末端轉(zhuǎn)移酶功能圖解 第四節(jié) DNA修飾酶 3‘突出末端 生命科學(xué)學(xué)院 二、 T4噬菌體多核苷酸激酶 來源 從 T4感染大腸桿菌細(xì)胞中分離出來。 用途： DNA 5’OH端磷酸化、標(biāo)記 DNA的 5’端。加熱 68 ℃ 可完全失活。 一、作用于單鏈的核酸外切酶 如： 大腸桿菌核酸外切酶 I（ exo I）；大腸桿菌核酸外切酶 Ⅶ （ exo Ⅶ ） 二、作用于雙鏈的核酸外切酶 如： 大腸桿菌核酸外切酶 Ⅲ （ exo Ⅲ ）； ?噬菌體核酸外切酶（ ? exo）； T7噬菌體基因 6核酸外切酶 三、既可作用于單鏈又可作用于雙鏈的核酸外切酶 如： Bal 31核酸酶 生命科學(xué)學(xué)院 DNA外切酶 切割方式 識別位點(diǎn) 單鏈 大腸桿菌核酸外切酶 I（ exo I） 5’?3’ 5’OH 大腸桿菌核酸外切酶 Ⅶ （ exo Ⅶ ） 5’?3’ 3’?5’ 5’P 3’OH 雙鏈 核酸外切酶 Ⅲ （ exo Ⅲ ） 3’?5’ 3’OH ?噬菌體核酸外切酶（ ? exo） 5’?3’ 5’P T7噬菌體基因 6核酸外切酶 5’?3’ 5’P 5’OH 單、雙鏈 Bal 31核酸酶 5’?3’ 3’?5’ 3’OH 不同核酸外切酶的特性比較 第五節(jié) 外切酶核酸 生命科學(xué)學(xué)院 第五節(jié) 外切酶核酸 生命科學(xué)學(xué)院 第六節(jié) 單鏈內(nèi)切核酸酶 一、 S1核酸酶 來源： 來源于稻谷曲霉（ Aspergillus oryzae） 功能： 是一種高度單鏈特異的核酸 內(nèi)切酶 。 用途： DNA聚合酶 I一起參加切口平移 DNA文庫 DNaseI足跡法測定 DNA結(jié)合蛋白在 DNA上的精確結(jié)合位點(diǎn) DNA 第六節(jié) 單鏈內(nèi)切核酸酶 生命科學(xué)學(xué)院 第七節(jié) RNA酶 一、核糖核酸酶 A 來源于牛胰臟，是一種內(nèi)切核糖核酸酶。 第七節(jié) RNA酶 用途： 在 cDNA克隆，合成第二鏈之前去除 RNA 。反應(yīng)終產(chǎn)物是嘧啶 3’磷酸及末端帶嘧啶 3‘磷酸的寡核苷酸。 酶量大可完全消化雙鏈， 中量，可在切口或小缺口處切割雙鏈 用途： (1)測定核酸分子的雜交程度； (2)去除 DNA片段中突出的單鏈尾巴； (3)打開 cDNA合成時形成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。 3’ HO P 5’ 3’ HO OH 5’ 3’ HO OH 堿性磷酸酶 5’ P OH 3’ 5’ 第四節(jié) DNA修飾酶 生命科學(xué)學(xué)院 第四節(jié) DNA修飾酶 生命科學(xué)學(xué)院 3)堿性磷酸酶的功能 防止線性化的載體份子自我連接 其中每條鏈上都有一個 nick，但轉(zhuǎn)入細(xì)菌后會被修復(fù)。具有抗熱性。 功能 催化 ?磷酸 從 ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈 DNA或 RNA的 5’OH端。 2. 催化非放射性的標(biāo)記物摻入到 DNA片斷的 3’末端： 生物素等，摻入后可產(chǎn)生熒光染料或抗生物素蛋白結(jié)合物的接受位點(diǎn)。 生命科學(xué)學(xué)院 第三節(jié) DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶 五、逆轉(zhuǎn)錄酶 （ reverse transcriptase） RNaseH活性 生命科學(xué)學(xué)院 第四節(jié) DNA修飾酶 一、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 來源及特點(diǎn)： 簡稱末端轉(zhuǎn)移酶（ terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)，能催化 5’脫氧核苷三磷酸進(jìn)行 5’→ 3’方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性 DNA分子的 3’OH末端。 來源 商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種： ?來自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒 (AMV)(42℃ )。 活性 ：聚合最適溫度為 7580℃ ，不具 3’ →5 ’ 外切酶活性，具 5’→3’ 外切活性 。 （二） T7噬菌體 DNA測序酶 通過對 T7DNA聚合酶進(jìn)行化學(xué)修飾，去除 3’?5’外切酶活性，使 DNA聚合能力和聚合速率提高了 3倍。 生命科學(xué)學(xué)院 第三節(jié) DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶 二、 Klenow片段 （二）用途 1. 3’端補(bǔ)平 ：補(bǔ)平限制性內(nèi)切酶切后形成的 3’隱蔽端 。分為：依賴于 DNA的 DNA聚合酶和依賴于 RNA的 DNA聚合酶。 DNA連接酶的部分性質(zhì) 連接酶 底物 輔助 因子 巰基 試劑 粘性末端 平末端 DNARNA 雜合體 RNARNA 雜合體 大腸桿菌 DNA 連接酶 可行 可行 不行 不行 NAD+ Mg2+ 不需要 T4DNA 連接酶 可行 可行 可行 可行 ATP Mg2+ 需 DTT 噬熱菌 DNA 連接酶 可行 不行 不行 不行 NAD+ Mg2+ 需要 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 DNA連接酶應(yīng)用圖解 （一）分子間的連接 （二）分子內(nèi)的連接 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 三、 DNA連接酶的反應(yīng)體系 四、影響連接反應(yīng)的因素 1. 插入片段與載體的濃度比例： 210:1 增加插入片段與載體的接觸機(jī)會，減少載體自我連接的現(xiàn)象 2. 反應(yīng)溫度：一般 4~16℃ 3. ATP濃度 10 T4 DNA Ligase Buffer 1μl pMD18T（ 30ng/μl） 1μl 已純化的 PCR產(chǎn)物 Xμl* T4 DNA Ligase 2~3Weiss Units ddH2O 至 10μl 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 平末端 DNA片段的連接 (補(bǔ)充 ) 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 平末端 DNA片段的連接 (補(bǔ)充 ) 生命科學(xué)學(xué)院 第二節(jié) DNA連接酶 平末端 DNA片段的連接 (補(bǔ)充 ) （ adaptor）連接法 問： 銜接物和DNA接頭有什么區(qū)別？？？ 銜接物（ linker） 是一種人工合成的雙鏈 DNA短片段，其上具有一個或數(shù)個在將與其連接的載體 DNA上不存在的限制酶識別位點(diǎn)，可按平齊末端連接法給平齊末端片段加上相同識別位點(diǎn)的銜接物，再用在銜接物中具有識別位點(diǎn)的合適限制酶切割，用常規(guī)方法連接的方法，提高平齊末端間的連接作用效率。 注意：缺口（或稱切口）和裂口的區(qū)別?。。。?！ 注：關(guān)于“ Gap”與“ Nick”的概念。它是一種能夠?qū)?DNA鏈上彼此相鄰的 3’羥基（ OH ）和 5’磷酸基團(tuán)（ P），在 NAD+或 ATP供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。 5) 二價離子用 Mg2+。這樣可以避免過度消化以及過高的甘油濃度。 星活性的特點(diǎn) : 限制酶識別序列特異性降低 例如： EcoRI（高 pH值或低鹽離子強(qiáng)度） 5’G AATTC3’變成 5’N AATTN3’，另有一種情況是對AATT中的 A、 T分辨不嚴(yán)格 商品化的限制酶一般都帶有專用緩沖液。 酶解時間可通過加大酶量而縮短，反之酶量較少時，可通過延長酶解時間以達(dá)到完全酶解 DNA的目的。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 六、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 （一）酶的純度 （二） DNA樣品的純度 DNA樣中混有蛋白質(zhì)、苯酚、氯仿、乙醇、 EDTA、SDS、 NaCl等 ， 都有可能抑制酶活性。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回 20℃ 冰箱。 通過縮短保溫時間、降低反應(yīng)溫度或減少酶的用量可達(dá)到局部消化的目的。 生命科學(xué)學(xué)院 第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶 五、 Ⅱ 限制性