第二章基因工程制藥新版7(編輯修改稿)
2024-11-19 22:12 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 以及檢測(cè)方法,雜質(zhì)和污染物 常用檢測(cè)方法 1：內(nèi)毒素 鱟試劑、家兔熱原法 2：宿主細(xì)胞蛋白質(zhì) 免疫分析、SDSPAGE、CE 3：其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)（如培養(yǎng)基） 免疫分析、SDSPAGE、HPLC、CE 4：殘余DNA NA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合 5：蛋白變異 肽譜、等電點(diǎn)聚焦（IEF）、HPLC、CE 6：甲酰基甲硫氨酸 肽譜、IEF、HPLC、CE 7：甲硫氨酸氧化 肽譜、氨基酸分析、質(zhì)譜、Edman分析 8：產(chǎn)物變性、聚合、脫氨基 凝膠分子篩、SDSPAGE、HPLC、CE 9：?jiǎn)慰寺】贵w親和配基脫落 免疫分析、SDSPAGE 10：氨基酸取代 肽譜、氨基酸分析、質(zhì)譜、Edman分析 11：微生物污染物 微生物學(xué)檢查 12：支原體污染物 微生物學(xué)檢查 13：病毒污染物 微生物學(xué)檢查,生物活性測(cè)定,（1）免疫測(cè)定法：重組蛋白質(zhì)是一種抗原，均有相應(yīng)的抗體、或單克隆抗體，可用放射免疫分析法、酶標(biāo)免疫法測(cè)定其免疫學(xué)活性。 （2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)法：根據(jù)目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)、藥理學(xué)特性，建立動(dòng)物模型，進(jìn)行各種指標(biāo)的測(cè)定。 （3）細(xì)胞培養(yǎng)體外效價(jià)評(píng)定法： （A）細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法 （B）3HTαR摻入法 （C）酶法細(xì)胞計(jì)數(shù)。,穩(wěn)定性考察,這是評(píng)價(jià)藥物有效性、安全性的重要手段。也是藥品貯存條件、使用期限的主要依據(jù)。 由于基因工程所生產(chǎn)出一蛋白質(zhì)都是生物活性物質(zhì)，它們對(duì)于溫度、氧化、光照、離子濃度、機(jī)械剪切等環(huán)境因素均十分敏感。常常會(huì)在貯存過(guò)程中發(fā)生脫氨、氧化、磺?；⒕酆?、降解等反應(yīng)。 穩(wěn)定性試驗(yàn)必須與一致性試驗(yàn)、純度測(cè)定、生物學(xué)效價(jià)試驗(yàn)等結(jié)合起來(lái)，進(jìn)行多方面的綜合評(píng)判。才能保證結(jié)果的客觀性。,產(chǎn)品一致性保證,是用來(lái)保證每一批生產(chǎn)出的最終產(chǎn)品在安全性、有效、含量、雜質(zhì)限度、穩(wěn)定性等方面都是一致的。 只有從原料開(kāi)始、到生產(chǎn)、到產(chǎn)品形成的每一步驟進(jìn)行嚴(yán)格的工藝要求、并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)手段，才能保證產(chǎn)品的一致性恒定。,產(chǎn)品的安全性,三致試驗(yàn)： （1）致畸 （2）致敏 （3）致癌,（五）：產(chǎn)品的保存要求,液態(tài)保存 固態(tài)保存,液態(tài)保存,（1）低溫保存在10℃到20℃以下的低溫環(huán)境，可保存蛋白質(zhì)制劑。 （2）在穩(wěn)定的pH條件下保存蛋白質(zhì)只有在很窄的pH范圍內(nèi)才能維持穩(wěn)定，即當(dāng)pH=pI（等電點(diǎn)）時(shí)，因此應(yīng)該小心調(diào)整保存蛋白質(zhì)的pH范圍。 （3）高濃度保存蛋白質(zhì)在高濃度溶液中比較穩(wěn)定，而在低濃度溶液內(nèi)，常常發(fā)生亞基解離、表面變性。,（4）真空保存蛋白質(zhì)在真空狀態(tài)、或者在惰性氣體中密閉保存，能抵抗氧化作用。 （5）保護(hù)劑保存： （A）某些蛋白質(zhì)在疏水環(huán)境中能夠長(zhǎng)期保存，這類穩(wěn)定劑有糖類、脂肪、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑。 （B）某些蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的極性環(huán)境中能長(zhǎng)期保存，這類穩(wěn)定劑有中性鹽類。 （C）某些蛋白質(zhì)由于含有半胱氨酸的巰基，容易被氧化，形成次磺酸、和二硫化物，這類穩(wěn)定劑有2巰基乙醇、二硫蘇糖醇。,固態(tài)保存凍干粉保存、結(jié)晶保存,蛋白質(zhì)含水超過(guò)10%時(shí)就容易失去活性。含水量下降到5%時(shí)，在室溫、或者冰箱中保存較為穩(wěn)定。但是在37℃時(shí)，活性顯著下降。 固態(tài)蛋白質(zhì)則較穩(wěn)定。 最好的方法是將蛋白質(zhì)制成凍干粉、或者結(jié)晶。它們具有很強(qiáng)的抗熱性和穩(wěn)定性，干燥器中在4℃以下，蛋白質(zhì)可保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。,十二、基因工程藥物的制造實(shí)例,（一） 干擾素α2b （二） 基因工程生產(chǎn)人胰島素,（一）干擾素α2b,根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性差異，干擾素（INF）分為α、β、γ、ω四種類型。又根據(jù)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)不同將干擾素分為α1b、α2a、 α2b等亞型。 基因工程菌的組建 基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn) 干擾素的制備 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求,基因工程菌的組建,人染色體上的干擾素基因只有1.5%，拷貝量極少，所以不能直接從人體的染色體上分離干擾素基因。 （1）步驟 （2）流程圖,(1)步驟,分離人白細(xì)胞干擾素mRNA ↓ 將mRNA注射到蟾蜍的卵母細(xì)胞之中 ↓ 測(cè)定雜合干擾素的活性基因，發(fā)現(xiàn)12S mRNA的活性最高 ↓反轉(zhuǎn)錄酶 以12S mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ↓ 將cDNA克隆到含四環(huán)素+氨芐抗性基因的pBR322質(zhì)粒之中 ↓ 將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12之中 ↓ （1）將每個(gè)克隆用粗得的干擾素mRNA進(jìn)行雜交， （2）將雜交所得陽(yáng)性克隆的DNA進(jìn)行再一次重組， （3）重組的DNA質(zhì)粒放到無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)中進(jìn)行試驗(yàn)性翻譯 （4）進(jìn)行多輪篩選最終得到能夠產(chǎn)
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