基因工程涉及的主要技術(shù)(編輯修改稿)
2025-01-26 09:24 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 不引物復性 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ 引物 引物 引物（ primer） : 4065oC DNA聚合酶按堿基配對原則在模板上延伸 DNA鏈。 （ 3） DNA鏈的延伸 TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ ACGTACGTA 5’ Taq Taq 72oC 理論上 2530次循環(huán)就可以合成 225230條 DNA。 變性 — 復性 — 延伸。 （ 4） 1個循環(huán)的結(jié)果 （ 5）新一輪循環(huán)開始 總體積 50100 ?l Buffer 緩沖液 dNTP 原料 Primer 引物（ ?mol/L） DNA分子 模板 （ 50100ng ） Taq酶 DNA聚合酶（ U/50 ?L ） ： 5. PCR的 應用 理論上只要一條模板鏈， 32次循環(huán)就可合成約 109條！ （ 1）擴增某一段 DNA 從基因組中擴增； 從載體上擴增； 組織樣本原位擴增； 微量殘留 DNA擴增； 分析模板序列； 在基因的某處引入核苷酸突變（缺失、重復、插入、替換等）。 （ 2）基因的體外誘發(fā) 技術(shù)關(guān)鍵： 利用引物的 5‘端序列不要求與模板嚴格配對，設(shè)計引物時引入突變序列。 五、分子雜交 概念：將存在亍凝膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移（印跡）亍固定化介質(zhì)上并加以檢測分析的技術(shù)。 可用亍從基因文庫中 釣 叏目的基因等。 目前常使用的主要有 Sourthern雜交、 Northern雜交、 Western雜交和原位雜交等。 核酸分子雜交 核酸分子雜交技術(shù)（ DNA/DNA or DNA/RNA），是在 1968年由華盛頓卡內(nèi)基學院（ Cavnegie Institute of Washington）的 Roy Britten及其同事發(fā)明的。 所依據(jù)的原理是，帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈 DNA或RNA，當它們混合在一起時，其相應的同源區(qū)段將會退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)。 DNADNA 雜交雙鏈分子 ? 同源或部分同源探針 ? 總 cDNA探針 ? 特異性 cDNA探針 ? 人工合成的寡核甘酸探針 探針標記 u放射性標記 32P， 3H， 35S， 14C， 125I 等 u 非放射性標記 地高辛，生物素，熒光素等 用于標記 dUTP （ a） （ b） （ c） （ d） （ e） 基因組 DNA DNA限制片段 硝酸纖維素濾膜 同探針同源雜交的基因 DNA片段 X光底片 Southern 凝膠轉(zhuǎn)移雜交技術(shù) 如圖 :基因組 DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，進行瓊脂糖凝膠電泳，將含有 DNA片斷的凝膠放入變性溶液變性后，將硝酸纖維膜 (NC)膜放在膠上，上面放吸水紙巾，利用毛吸作用使膠DNA轉(zhuǎn)移質(zhì) NC膜上，然后利用雜交技術(shù)檢測 NC膜上的 DNA片斷。 1979年， ，是將 RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。由于這種方法與薩瑟恩 DNA印跡雜交技術(shù)十分類似，所以叫做諾賽恩 RNA印跡技術(shù)（ Northern blotting）但 它 不需要限制性內(nèi)切酶切割。用于基因表達的特異性分析和定量分析。 而將 蛋白質(zhì) 從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素 125I標記的 特定蛋白質(zhì) 的 抗體 進行反應，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（ Western blotting）。
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