【文章內(nèi)容簡介】 探針的標(biāo)記： ABC熒光標(biāo)記 雜交探針的標(biāo)記： ABC顯色酶標(biāo)記 地高辛－ dUTP 雜交探針的標(biāo)記：地高辛系統(tǒng)標(biāo)記 兩種地高辛－ dUTP顯色系統(tǒng) DIG探針雜交過程 雜交探針的制備： 用于菌落或噬菌斑原位雜交的探針必須滿足下列條件： 單鏈結(jié)構(gòu) （ 雙鏈 DNA可用堿變性 ） 足夠長度 （ 至少 12個 堿基 ） 內(nèi)部不含互補(bǔ)區(qū) 探針的制備方法或來源包括： 人工合成 cDNA合成 同源序列 mRNA GACCTA AAGCGGATCG TAGGTC GACCTA CTGGAT A A G C T G G G C A T4PNP介導(dǎo)的末端標(biāo)記 探針的標(biāo)記方法 切口移位 (平移 )法 引物延伸法 末端標(biāo)記法 體外轉(zhuǎn)錄或反錄法 ① 末端標(biāo)記 TdT介導(dǎo)的末端標(biāo)記 T4Pol介導(dǎo)的末端標(biāo)記 ② DNA聚合酶 介導(dǎo)的 切口平移 標(biāo)記 ③ DNA聚合酶 介導(dǎo)的 隨機(jī)引物法 ④ 逆轉(zhuǎn)錄酶 介導(dǎo)的 反轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 3’ AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5’ mRNA 反轉(zhuǎn)錄酶 Mg2+ dNTP + pppdATP （ a32PdATP） 5’ TTTTTTTTTTT 5’ mRNA 3’ cDNA 3’ AAAAAAAAAAACCAGCTTCCGAACTGATTTAGGCT 5’ TTTTTTTTTTTGGTCGAAGGCTTGACTAAATCCGA 轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記 Southern 雜交 (Southern blotting ) 目標(biāo) DNA 經(jīng)過限制性酶切并通過瓊脂糖凝膠電泳 ① NaOH 變性 ② NaCl/1M Tris（ ） 中和 ③使 DNA 仍保持單鏈狀態(tài) ① 將凝膠上的 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上 ②通過 80℃ 處理或紫外線照射將 DNA 固定在濾膜上 將結(jié)合了 DNA 分子的濾膜先與特定的預(yù)雜液進(jìn)行 預(yù)雜交 ， 將濾膜的空白處用魚精 DNA 或牛奶蛋白封閉起來，防止在雜交過程中濾膜本身對探針的吸附 雜交 ：在一定的溶液條件和溫度下，將標(biāo)記的核酸探針與濾膜混合，如果濾膜上的 DNA 分子存在與探針同源的序列，那么探針將與該分子形成雜合雙鏈，從而吸附在濾膜上 洗膜 ：經(jīng)過一定的洗滌程序?qū)⒂坞x的探針分子除去 檢測： 放射性標(biāo)記、檢測 非放射性標(biāo)記、檢測 分子雜交爐 紫外交聯(lián)儀 M，地高辛（ DIG）標(biāo)記的分子量標(biāo)準(zhǔn)（ λDNA/ HindⅢ ） 13，蘇云金芽胞桿菌 YBT1520 菌株的總 DNA 分別經(jīng) KpnⅠ PstⅠ 、 PstⅠ 和 Kpn Ⅰ 酶切 以 cry1Aa 殺蟲晶體蛋白基因中的 728bp 片段作探針，通過隨機(jī)引物標(biāo)記的方式，用 DIG 標(biāo)記探針 Northern 雜交 (Northern blotting ) (A) RNA is isolated from various tissues and is separated by size using gel electrophoresis. (B) The gel is then placed on a paper wick, which absorbs an ionic solution from a trough (C) A filter that traps RNA is placed above the gel, and blotting paper is placed above the filter. Capillary action draws the solution through the gel, trapping the RNA on the filter (D) The filter is incubated with radioactive singlestranded DNA plementary to the mRNA of interest (E) After any unbound DNA is washed off, autoradiography localizes the mRNA in the samples that contain it. (F) Drawing of a developmental Northern blot showing the presence of Pax6 mRNA in the eye, brain, and pancreas of a mammalian embryo SBEIII WT SBEIII OX WT SBEIII OX 檢測基因的表達(dá)水平 Northern的應(yīng)用實例 、 Western 印跡法 (Western blotting) 檢測蛋白質(zhì)，即將電泳分離的非標(biāo)記蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗體對蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及定量的方法 主要步驟： ?蛋白質(zhì)樣品的制備 ?SDS聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE)電泳 ?蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移： NC膜 ?靶蛋白的免疫學(xué)檢測 ?靶蛋白于第一抗體（一抗）反應(yīng) ?與標(biāo)記的第二抗體（酶標(biāo)，二抗）反應(yīng) ?顯色反應(yīng)：酶促反應(yīng) 三種分子雜交技術(shù)的比較 Southern Northern Western 、原位雜交 (in situ hybridization) ? 將標(biāo)記的核酸探針與 細(xì)胞或組織中的 核酸進(jìn)行雜交，稱為原位雜交。 ? 特點 – 能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究 – 不需從組織或細(xì)胞中提取核酸，對含量極低的靶序列靈敏度高 – 能準(zhǔn)確反映組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài) 細(xì)胞或組織的原位雜交 檢測特異 mRNA是否存在。 步驟 ： 細(xì)胞或組織的固定后置于載玻片上 組織細(xì)胞雜交前的預(yù)處理 – 用去垢劑或蛋白酶除去核酸表面蛋白質(zhì) 探針的選擇和標(biāo)記 雜交 雜交結(jié)果檢測 基本步驟 硫轉(zhuǎn)蛋白在擬南芥根部的原位雜交 Fluorescent in situ hybridization chromosomes Multicolor fluorescence in situ hybridization of Zea mays L. chromosomes. Study of maize chromosomes has been hampered by a lack of chromosome features. 菌落或噬菌斑雜交 ，將生長在培養(yǎng)基平板上的菌落或噬菌斑按照其原來的位臵不變地轉(zhuǎn)移到濾膜上，并在原位發(fā)生溶菌、DNA變性和雜交作用 基本程序是：將被篩選的 大腸桿菌菌落或噬菌斑 ，從其生長的瓊脂平板中 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜 上，進(jìn)行適當(dāng)?shù)?溫育 ，保藏原來的菌落平板作為參照，以便從中 挑取陽性克隆 。 復(fù)制平板和膜轉(zhuǎn)印時應(yīng)在平板和膜上的一側(cè)做三個對應(yīng)的標(biāo)簽 ① ②酸中和 ③蛋白酶處理 ④漂洗細(xì)胞碎片 ⑤ 80℃ 烘烤 與 32P標(biāo)記的探針雜交 放射性自顯影 在參照平板上挑取目標(biāo)陽性克隆（陽性菌落）擴(kuò)大培養(yǎng) 菌落原位雜交 噬菌斑原位雜交 ? PCR技術(shù) PCR技術(shù)發(fā)展簡史 聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase Chain Reaction, PCR)是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，利用單鏈寡核苷酸引物對特異DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增的一種方法 Applied Biosystems GeneAmp PCR 9700 Thermocycler Dr. Hargobind Khorana （ 1922－） Khorana(1971)等提出“在體外經(jīng) DNA變性，與適當(dāng)引物雜交，用 DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成 tRNA基因”。 序列分析方法未成熟 寡核苷酸引物合成還處于手工及半自動合成階段 熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶未見報道 因此這個想法沒有實際意義??！ 但是： The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1968 for their interpretation of the geic code and its function in protein synthesis 加速分子生物學(xué)發(fā)展進(jìn)程的一項 “簡單而晚熟”技術(shù) The Nobel Prize in Chemistry 1993 for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method Kary B. Mullis 1944－ Dr. Mullis joined the Cetus Corp. in Emeryville, California, as a DNA chemist in 1979 1983年， Mullis發(fā)明了 PCR技術(shù)，使 Khorana的設(shè)想得到實現(xiàn)。 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是 Klenow片段 Klenow片段不耐熱，每個循環(huán)加一次酶 是一個笨拙的中看不中用的實驗室方法 擴(kuò)增的 DNA片段很均一，真實性較高，只有所期望的一種 DNA片段 1988年 Keohanog改用T4DNAPol 但仍是每個循環(huán)加一次酶 1988年 Saiki等將耐熱 DNA聚合酶（ Taq）引入了 PCR技術(shù) Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. (1988) Primerdirected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239:487491. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. (1985) Enzymatic amplification of betaglobin genomic sequences and restriction site analyses for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230:13501354. PCR技術(shù)基本原理和操作 類似于 DNA的 天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物 基本反應(yīng)步驟 變性 退火 延伸 變性 PCR技術(shù)基本原理 ① 模板 DNA的變性 模板 DNA經(jīng)加 熱至 93℃ 左右一定時間后，使模板 DNA雙鏈或經(jīng) PCR擴(kuò)增形成的雙鏈 DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備 ② 模板 DNA與引 物的退火 (復(fù)性 ) 模板 DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃ 左右，引物與模板 DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合； ③ 引物的延伸 DNA模板 引物結(jié)合 物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈 預(yù)變性 模板 DNA dNTP 引物 Buffer TaqDNA聚合酶 94oC5min 模板 DNA dNTP 引物 B