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何水林版基因工程第四章基因工程的主要技術(shù)與原理-資料下載頁

2025-09-11 20:34本頁面
  

【正文】 ~ 94℃ 1min足以使模板 DNA變性,若低于93℃ 則 需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或 PCR產(chǎn)物完全變性,就會導(dǎo)致 PCR失敗。 變性溫度與時間 退火溫度是影響 PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至 40℃ ~ 60℃ ,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板 DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長 度。對于 20個核苷酸, G+C含量約 50%的引物, 55℃ 為選擇最適退火溫度的起點較為理想。 退火 (復(fù)性 )溫度與時間: 引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度: Tm值 (解鏈溫度 )=4(G+C)+ 2(A+T) 復(fù)性溫度 =Tm值 (5~ 10℃ ) 在 Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高 PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為 30~ 60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。 Taq DNA聚合酶的生物學活性: 70~ 80℃ 150核苷酸 /S/酶分子 70℃ 60核苷酸 /S/酶分子 55℃ 24核苷酸 /S/酶分子 高于 90℃ 時, DNA合成幾乎不能進行。 延伸溫度與時間: PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在 70~ 75℃ 之間,常用溫度為 72℃ ,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴增片段的長度而定,一般 1Kb以內(nèi)的 DNA片段,延伸時間 1min是足夠 的。 3~4kb的靶序列需 3~ 4min;擴增 10Kb需延伸至 15min。延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些。 循環(huán)次數(shù)決定 PCR擴增程度。 PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板 DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在 30~ 40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。 循環(huán)次數(shù) ⑦ PCR實驗操作過程 PCR產(chǎn)物純化 PCR產(chǎn)物純化試劑盒 PCR產(chǎn)物電泳 ⑧ PCR常見問題 正對照有條帶,而樣品則無 原因: 該 Buffer對樣品不合適 引物設(shè)計不當或者發(fā)生降解 模板 :含有抑制物,含量低 反應(yīng)條件:退火溫度太高,延伸時間太短 優(yōu)化 純化模板或者使用試劑盒提取模板 DNA 更換 Buffer或調(diào)整濃度 重新設(shè)計引物(避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)) 或者換一管新引物 降低退火溫度、延長延伸時間 非特異性擴增 現(xiàn)象: PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致 ,或大或小 , 或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶 原因: 1. 引物特異性差 2. 酶純度不高 3. Mg2+濃度偏高 4. 退火溫度偏低 5. Buffer不合適 6. 循環(huán)次數(shù)過多 解決: 1. 重新設(shè)計引物或者使用巢式 PCR 2. 換用高純度的酶 3. 降低鎂離子濃度 4. 適當提高退火溫度或使用二階段溫度法 5. 更換 Buffer 6. 減少循環(huán)次數(shù) 拖尾 現(xiàn)象:產(chǎn)物在凝膠上呈 Smear狀態(tài) 原因: 1. 酶量過多 2. 模板不純 3. 循環(huán)次數(shù)過多 4. dNTP、 Mg2+濃度偏高 5. 退火溫度偏低 6. Buffer不合適 解決: 1. 適量用酶 2. 純化模板 3. 減少循環(huán)次數(shù) 4. 適當降低 dNTP和鎂離子的濃度 5. 適當提高退火溫度 6. 更換 Buffer 假陽性 現(xiàn)象: 空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物 原因: 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 對策: 1. 操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外 2. 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。 3. 各種試劑最好先進行分裝,然后低溫貯存 。 雙脫氧法測序 (Sanger dideoxy procedure ) 5 DNA序列的測定 (Sanger dideoxy procedure ) 大規(guī)模測序的策略和測序技術(shù)的發(fā)展 化學法測序 (MaxamGilbert procedure) Frederick Sanger DNA的合成過程中,在合成的 DNA鏈的 3′末端,依據(jù)堿基配對的原則,通過生成新的 3′, 5′磷酸二酯鍵,使 DNA鏈合成終止,產(chǎn)生短的 DNA鏈。產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的 DNA鏈。 雙脫氧法測序 (Sanger dideoxy procedure ) ① 雙脫氧法測序 原理 雙脫氧法測序基本過程 自動測序電泳裝置 An example of a portion of a chromatogram from automated sequencing Automated sequencing is based on the dideoxy methodology, but four different fluorescent dyelabelled ddNTPs are used. Thus each fluorescent label can be detected by its characteristic spectrum. The products are separated by automated electrophoresis and the bands detected by fluorescence spectroscopy. Sanger測序儀采用 96個毛細電泳管的陣列,可以同時進行 96個這樣的測序反應(yīng),每個反應(yīng)得到的 Read長度可以達到 1000bp以上 MEGABACE1000 DNA測序 儀 多道移液器 96孔反應(yīng)板 ② 雙脫氧法測序 程序 將待測基因序列打斷成較短重疊的 DNA片段群 DNA片段連入載體,在 體內(nèi)擴增,挑取單菌落,分離純化重組載體測序 加入 DNA聚合酶,dNTP以及帶有熒光標記的雙脫氧核苷酸 ddNTP 凝膠電泳,檢測標記過的核苷酸片段的熒光信號。根據(jù)重疊序列,通過軟件處理,DNA序列信息 測序載體 pUC:雙鏈質(zhì)粒載體,衍生的載體很多,不同商業(yè)公司有所不同,但基本均由 pUC衍生而來,使用時需先變性 M13系列和 pUC系列的測序載體的使用避免了使用物理方法分離大量的 DNA M13:單鏈噬菌體載體,目前很少采用 測序 DNA聚合酶 ① DNA聚合酶 Ⅰ Klenow片段 5′→3′ 的聚合酶活性, 3′→5′ 的外切酶活性 持續(xù)合成能力不強,不能復(fù)制富含二級結(jié)構(gòu)的模板區(qū) 以 ddNTP為底物的能力遠比在 dNTP低 易受 DNA制備時經(jīng)常產(chǎn)生的污染物的影響,且只對單鏈模板有效 ② T7噬菌體聚合酶 (測序酶 ) 是一種經(jīng)過修飾的 T7噬菌體 DNA聚合酶,缺乏 3′→5′ 外切酶活性 能產(chǎn)生出非常漂亮的 DNA梯帶,每條帶都具有相似的強度,可讀的DNA序列可覆蓋凝膠的全長 測序酶催化 ddNTP結(jié)合的速率是 dNTP的 33% 具有 , ,能對折疊成二級結(jié)構(gòu)的模板起作用 測序酶 526位氨基酸為 Tyr,若換成 Phe,結(jié)合 ddNTP的能力下降2022倍,將 Ⅰ 或 TaqdnaPol類似氨基酸換面 Tyr其結(jié)合 ddNTP的能力提高 8000倍 ③ TaqDNA聚合酶 它在高溫下( 70℃ )進行終止鏈反應(yīng)的能力可減少測序反應(yīng)中由于模板DNA上引物假結(jié)合位點與引物退火錯配產(chǎn)生的相關(guān)問題 在測序凝膠的放射自顯影片上條帶間的強度不同,從頂部到底部條帶逐漸減弱,出現(xiàn)陰影。 可用于富含二級結(jié)構(gòu)的模板 催化 ddNTP結(jié)合的與該區(qū)模板 DNA序列的影響 TaqDNAPol和 PfuPol催化 ddNTP結(jié)合的速率比結(jié)合 dNTP的速率低兩個數(shù)量級 通用引物的使用避免了合成不同引物的麻煩 ( M13正反向, T7, SP6等) M13 Primers( TaKaRa 公司) M13 Primer各引物位置圖 堿基序列: 5′CATAC GATTT AGGTG ACACT ATAG3′ SP6 Promoter Primer 形態(tài) 凍結(jié)干燥品??捎脺缇?TE Buffer (pH ~ ) 溶解后使用 用途 作為具有 SP6 Promoter載體的測序用引物或 PCR用引物 化學法測序 (MaxamGilbert procedure) 經(jīng) 凝膠電泳 按大小分離和放射自顯影后,根據(jù) X光片所顯現(xiàn)的相應(yīng)條帶,直接讀出待測 DNA片段的核苷酸順序 是一個 DNA化學降解的過程,而不是生物合成過程 化學試劑處理具有 末端標記 的 DNA片段,造成堿基的 特異性切割 ,由此產(chǎn)生一組具有各種不同長度的 DNA鏈的反應(yīng)混合物 注意:只能標記一個堿基,多堿基標記會產(chǎn)生錯誤。 標記方式: 羥基磷酸化反應(yīng) 、 大腸桿菌聚合酶 I Klenow片段及 [α32P] dNTP標記 、 用末端轉(zhuǎn)移酶標記 DNA片段的 3′端 G系統(tǒng); pH 硫酸二甲酯 → G → m7G →C8~N9 斷裂 → 脫 G A+G系統(tǒng); pH 哌啶甲酸( pidine) → 嘌呤環(huán) N質(zhì)子化 → 脫嘌呤 C系統(tǒng); mol/L NaCl(高鹽) C + 肼( hydrazine) → 脫 C T + C系統(tǒng)(非高鹽條件) 肼 (hydrazine) → 打開嘧啶環(huán) → 重新 5C環(huán)化 → 脫嘧啶 化學降解法測序基本過程 生物信息分析 普通的序列分析軟件 序列的拼裝: CAP( contig assembling programme) 同源性的比較: BLAST , ClustalW等。 集成軟件:如 BioEdit等。 提供如少數(shù)序列的拼裝,同源性的比較,開放閱讀框的查找,酶切位點的查找等功能。 學會利用豐富的網(wǎng)上資源。 測序技術(shù)的發(fā)展 ? 雙脫氧末端終止法 (Sanger 測序法 ) – 1970s 同位素標記,手工 – 1980s 熒光標記,自動 – 1990s 毛細管電泳 ? 合成測序法(第二代測序) – 焦磷酸測序( Pyrosequencing, Roche/454) – 合成測序( SequencingBySynthesis, Illumina/Solexa) – 連接測序( SequencingByLigation, ABI/SOLiD) ? 單分子測序技術(shù)(第三代測序) – Helicos – Pacific Biosciences – Oxford Nanopore 158 SOLID測序的準確度高,原始堿基數(shù)據(jù)的準確度大于%,而在 15X覆蓋率時的準確度可以達到 %,是目前第二代測序技術(shù)中準確度最高的。 第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序( Sequencing by Synthesis),即通過捕捉新合成的末端的標記來確定 DNA的序列 現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括 Roche/454 FLX Illumina/Solexa Genome Analyzer Applied Biosystems SOLID system 454 FLX的測序片段比較長,高質(zhì)量的讀長( read)能達到 400bp Solexa測序性價比最高,不僅機器的售價比其他兩種低,而且運行成本也低,在數(shù)據(jù)量相同的情況下,成本只有 454測序的 1/10
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