基因表達和基因重組(存儲版)
【正文】 HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CG重組體 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CGGCC TAGCC TAGA TC CGGA TC CG載體自連 目的基因自連 同一限制酶切位點連接 不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接 GAATT CCT TAAG AGA TCTTC TAGAEco RⅠ 切割位點 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTABg lⅡ 切割位點 AATTC GATC TAGA ATTCGGATCTAAATTC G ATC TAG+ EcoRⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAT4 DNA連接酶 15186。 載體 DNA 5180。 5180。 5180。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ 受體菌條件 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) 導入方式 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) （四）重組 DNA導入受體菌 （五）重組體的篩選 1. 直接選擇法 (1) 抗藥性標記選擇 (2) 標志補救 (marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 2. 免疫學方法 如免疫化學方法及酶免檢測分析等 (插入失活法) 抗藥性標記選擇 α互補 α 互補的檢測 原位雜交 Southern印跡 雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出 重組 DNA技術操作過程可形象歸納為 小 結 分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體 接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體菌 篩 篩選重組體 重組 DNA技術操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 表達體系的建立 表達載體的構建 受體細胞的建立 表達產(chǎn)物的分離純化 （六）克隆基因的表達 1. 原核表達體系 （ ） 標準： 選擇標志 強啟動子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點 不宜表達真核基因組 DNA 不能加工表達的真核蛋白質(zhì) 表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusion body) 很難表達大量可溶性蛋白 大鼠胰島素原 cDNA 的表達和分泌 優(yōu)點： 可表達克隆的 cDNA及真核基因組 DNA 可適當修飾表達的蛋白質(zhì) 表達產(chǎn)物分區(qū)域積累 缺點： 操作技術難、費時、經(jīng)濟 轉(zhuǎn)染 —— 將表達載體導入真核細胞的過程 方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 2. 真核表達體系 酵母、昆蟲、乳類動物細胞 表達載體 pFASTBACI 的物理圖譜 （一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認識疾病的分子機制。 目 錄 演講完畢，謝謝觀看！ 。 人工接頭及其應用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5180。
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