高中生物基因重組與基因工程大學(xué)-文庫(kù)吧
2024-12-24 13:36 本頁(yè)面
【正文】 164 普羅威登細(xì)菌 PstⅠ CTGCAG SalpⅠ Streptomyces albus Subspecies pathocidicus 白色鏈球菌 SalⅠ GTCGAC AvaⅠ XhoⅠ 15 限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用 通過(guò)切割不同來(lái)源 DNA雙鏈的特異堿基序列， 產(chǎn)生 含有黏性末端或平端的、長(zhǎng)度不同的 DNA片段。 用于 DNA重組、制備探針、分子雜交、DNA序列分析等。 二、 DNA聚合酶 （ 最常用的 DNA聚合酶有以下 4種 ） DNA聚合酶 Ⅰ （全酶） DNA聚合酶 Ⅰ 大片段 —— Klenow片段 Taq DNA聚合酶 T4 噬菌體 DNA聚合酶 ㈠ DNA聚合酶 Ⅰ DNA聚合酶 Ⅰ （ DNA pol Ⅰ ） 是一個(gè)具有 3 種酶活性的多功能性酶。 包括： 5ˊ →3 ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ →3 ˊ 核酸外切酶活性 3ˊ →5 ˊ 核酸外切酶活性 DNA pol Ⅰ 應(yīng)用 ⑴ 常用來(lái) 催化 DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性 DNA 探針 ； ⑵ cDNA第二條鏈的合成； ⑶ 對(duì) DNA3?突出末端進(jìn)行標(biāo)記； ⑷ DNA序列分析。 E. coli DNA pol. Ⅰ 催化缺口平移 * T * T * T * T Mg 2+ D N a s e I 539。 339。 339。 539。 339。 539。 539。 339。 339。 539。 539。 339。 339。 539。 539。 339。 339。 539。 dATP,dCTP,dGTP [? 32 P] dTTP E. coli DNA POL I ㈡ Klenow片段（ DNA ） Klenow片段用途 ⑴ 補(bǔ)齊雙鏈 DNA的 3ˊ 末端； ⑵ 用標(biāo)記堿基補(bǔ) 齊 3ˊ 末端 ； 聚合酶Klen ow DN A [ 32P]d NT Pα雙鏈 DNA粘端539。外切酶Ⅲ變性+539。339。339。539。339。539。339。539。339。339。539。539。539。539。339。339。標(biāo)記探針標(biāo)記末端⑶ 用于 cDNA克隆中第二股鏈的合成 ； ⑷ DNA序列分析。 ㈢ Taq DNA pol（耐熱 DNA聚合酶） 作用特點(diǎn) 1） Taq DNA pol催化 DNA合成的最適溫度范圍 70 ? 75℃ ， 2） 95℃ 以上高溫，半小時(shí)不失活， 3） 最適合用于 聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR） 。 三、逆轉(zhuǎn)錄酶 (reverse transcriptase) 特點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下 3種酶 活性： ⑴ 以單鏈 RNA為模板， 催化合成 cDNA單鏈 ⑵ 具有 RNase H 活性，能水解 RNA:DNA雜交鏈中的 RNA ⑶ 以 DNA為模板， 催化合成 cDNA雙鏈。 逆轉(zhuǎn)錄酶的應(yīng)用： ⑴ 將 mRNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，構(gòu)建 cDNA文庫(kù) ； ⑵ 補(bǔ)平和標(biāo)記 5ˊ 末端突出的 DNA片段； ⑶ 代替 Klenow酶用于 DNA序列分析； ⑷ 制備雜交探針等。 四、 DNA連接酶 (DNA ligase) 催化雙鏈 DNA中一條鏈的 3ˊ － OH與另一條鏈的5ˊ － PO3H2形成磷酸二酯鍵 ， 從而構(gòu)成完整的 DNA長(zhǎng)鏈 。 DNA連接酶的用途 （ 1） 兩個(gè)雙鏈 DNA片段連接起來(lái) 5ˊ ACG AATTCGT3ˊ T4DNA連接酶 5ˊ ACGAATTCGT3ˊ 3ˊ TGCTTAA GCA5ˊ 3ˊ TGCTTAAGCA5ˊ （ 2） 修補(bǔ)帶有缺口的雙鏈 DNA分子 T4DNA連接 酶 五、堿性磷酸酶 （ alkaline phosphatase） 能夠催化水解去除 DNA或 RNA5ˊ 端的磷酸基團(tuán)。 用途 ⒈ 制備載體 時(shí)，用堿性磷酸酶處理去除載體分子 5ˊ －端磷酸基后，可防止載體自身環(huán)化連接，提高重組效率。 ⒉ 用 32P標(biāo)記 539。端前，去除 539。P，再通過(guò)激酶作用把放射性核苷酸加到 539。端進(jìn)行標(biāo)記 。 六、末端 （脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 作用 將標(biāo)記或未標(biāo)記的 dNTP加到 DNA的 3ˊ — OH末端；也可催化載體分子或待克隆的 DNA片段上加上互補(bǔ)的同聚尾 ， 便于進(jìn)一步連接 。 應(yīng)用 ① 探針標(biāo)記 G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾 ， 以便于進(jìn)行連接 3180。 3180。 重要的工具酶 工具酶 活性 限制性核酸內(nèi)切酶 識(shí)別特異堿基序列，切割 DNA T4 DNA連接酶 催化 DNA5ˊ 磷酸與 3ˊ 羥基 形成磷酸二酯鍵 DNA聚合酶 以 DNA為模板合成 DNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 以 RNA為模板合成 cDNA 堿性磷酸酶 切除 5?－ 末端磷酸 T
醫(yī)療健康相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1