基因工程制藥(存儲(chǔ)版)
【正文】 程 （ geic engineering）是指在基因水平上，采用與工程設(shè)計(jì)十分類似的方法，按照人類的需要進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后按設(shè)計(jì)方案創(chuàng)建出具有某種新的性狀的生物新品系，并能使之穩(wěn)定地遺傳給后代。可充當(dāng)克隆載體的 DNA分子有質(zhì)粒 DNA、噬菌體 DNA和病毒 DNA。 這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端 (patible end)。 539。 539。 5. DNA聚合酶 Ⅰ 大片段 ——Klenow片段 Klenow片段用途 ⑴ 補(bǔ)齊雙鏈 DNA的 3ˊ末端； ⑵ 用標(biāo)記堿基補(bǔ) 齊 3ˊ末端 ； 聚合酶K l e n o w D N A [ 32P ] d N T Pα雙鏈 DNA粘端5 39。539。339。 應(yīng)用 ① 探針標(biāo)記 G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾 ， 以便于進(jìn)行連接 3180。 ④分子量小，拷貝數(shù)高。 （ 3）利用基因工程技術(shù)可以發(fā)掘出更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)。 ? 八十年代中期 PCR技術(shù)發(fā)明 ? 1985年 第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊）培育成功。 PCR產(chǎn)物可以不經(jīng)過酶切直接與T載體連接， T/A克隆 ? 隨后就可以利用質(zhì)粒上插入基因兩側(cè)的酶切位點(diǎn)來克隆基因。一微克 pUC18共有 1011個(gè)分子（ 1017 / 2686 660），即每 3400個(gè) pUC18分子才有一個(gè)分子進(jìn)入受體細(xì)胞 在實(shí)際操作過程中，轉(zhuǎn)化一微克 pUC18共需 2ml感受態(tài)細(xì)胞，大約含有 2 1010個(gè)大腸桿菌細(xì)胞，也就是說， 每 200個(gè)細(xì)胞只有一個(gè)細(xì)胞能接納 pUC18 DNA 。當(dāng)培養(yǎng)基中有 IPTG時(shí)，使含此質(zhì)粒的菌在 Xgal培養(yǎng)基上形成 藍(lán)色菌落 。 抽提少量重組 DNA→PCR 擴(kuò)增 → 電泳鑒定 →序列分析。 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH 。是基因克隆最常用的檢測方法。轉(zhuǎn)化細(xì)胞就不能生長在含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)平板上。 （ 3）大腸桿菌的 ?噬菌體轉(zhuǎn)染 酵母的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法 （ 1）乙酸鋰轉(zhuǎn)化法 （ 2）原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法 （ 3）電轉(zhuǎn)化法 （二）轉(zhuǎn)化率 轉(zhuǎn)化率 單位質(zhì)量的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生 轉(zhuǎn)化子 的數(shù)量。 （三）提高重組率的方法 加大外源基因片段與載體的比例 選擇基因序列固有的酶切位點(diǎn) 在利用 PCR擴(kuò)增基因的同時(shí)引入酶切位點(diǎn) 利用中間載體提供酶切位點(diǎn) 加大外源基因片段與載體的比例 （ 1）外源基因片段與載體的比例為 5:110:1 （ 2） 5’ 末端去磷酸化 選擇基因序列兩側(cè)固有酶切位點(diǎn) 選用酶切位點(diǎn) ,不能在基因序列內(nèi)部 雙酶切產(chǎn)生粘端連接 單酶切 粘端連接 平端連接 在利用 PCR擴(kuò)增基因的同時(shí)引入酶切位點(diǎn) 利用 PCR擴(kuò)增基因時(shí)，在引物序列中加入特定的限制性酶切位點(diǎn) 序列，在擴(kuò)增基因的兩側(cè)就帶有了該特定酶切位點(diǎn)。 ? 1978年 Genentech公司生產(chǎn)出世界上第一種基因工程蛋白藥物 人胰島素。 四、基因工程制藥的優(yōu)點(diǎn) （ 1）利用基因工程技術(shù)可以生產(chǎn)出過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽。 ②能攜帶外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞，或游離在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自我復(fù)制，或整合到染色體 DNA上隨染色體 DNA的復(fù)制而復(fù)制。端進(jìn)行標(biāo)記 。539。539。 特點(diǎn) 逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下 3種酶 活性： ⑴ 以單鏈 RNA為模板， 催化合成 cDNA單鏈 ⑵ 具有 RNase H 活性，能水解 RNA:DNA雜交鏈中的 RNA ⑶ 以 DNA為模板， 催化合成 cDNA雙鏈。 339。 539。 粘性末端 (sticky end) 是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的 5ˊ －末端突出和3ˊ －末端突出的堿基序列相互間具有互補(bǔ)性 。這是為“攜帶”感興趣的外源 DNA、實(shí)現(xiàn)外源 DNA的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。 同年，加利福尼亞的 博耶（ Boyer） 也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn)。 1979年， Bltimore和 Temin領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)研究小組分別在各自的工作中發(fā)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄酶。 1970年 Smith和 Wilcox在流感嗜血桿菌中分離并純化限制性內(nèi)切酶 Hind Ш ，使 DNA分子的切割成為可能。將這種工程化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌，在含有四環(huán)素和青霉素的平板中篩選重組菌落。
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