重組dna技術(shù)與基因工程-閱讀頁(yè)
2024-09-30 21:50本頁(yè)面
【正文】 程菌在一個(gè) 240L的發(fā)酵罐 中培養(yǎng)，最終可獲得 90克 22nm的 HBsAg顆粒，足夠制成 900萬(wàn)份 乙肝 疫苗。 由于不少藥用糖蛋白需要唾液酸化 ，因此其生產(chǎn)目前只能依靠哺乳動(dòng)物受體 ， 因?yàn)楹笳吣苓M(jìn)行人樣化的 N糖基化 反應(yīng) ， 包括在末端加唾液酸的能力 。 然而 ， 野生型酵母往往將高甘露糖型的多糖鏈加在蛋白質(zhì)上 ， 直接影響表達(dá)產(chǎn) 物在人體內(nèi)的穩(wěn)定性與功效。 巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2022 敲除 4個(gè)基因，摧毀 巴斯德畢赤酵母原有的超糖基化系統(tǒng)： Doch1， Dpno1， Dmnn4B， Dbmt2 導(dǎo)入 9個(gè)基因，構(gòu)建 人的糖基化系統(tǒng)： UgnT：小鼠的 UDPN乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 UgnT：克魯維酵母的 UDPN乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 MnsI：小鼠的 a1,2甘露糖苷酶 I MnsII：果蠅的 a1,2甘露糖苷酶 II GnTI：人的 b1,2N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 I GnTII：大鼠的 b1,2N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶 II GalE：裂殖酵母的 半乳糖差向異構(gòu)酶 GalE：果蠅的 UDP半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 GalT： 人的 b1,4半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶 YSH577 rEPO 巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2022 YSH577 rEPO JC308 WT RDP750 b1,NGlcNAc b1,4GlcNAc b1,2GlcNAc b1,4Man a1,6Man a1,3Man a1,2Man b1,4Gal 巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2022 YSH577 rEPO 再導(dǎo)入 5個(gè)基因，構(gòu)建 末端唾液酸的添加系統(tǒng)： GNE：人的 UDPN乙酰葡糖胺 2差向異構(gòu)酶 / SPS：人的 N乙酰甘露糖胺丙酮酸 9磷酸合成酶 CSS：人的 CMP唾液酸合成酶 CST：小鼠的 CMP唾液酸運(yùn)輸因子 ST： 人的 唾液酸轉(zhuǎn)移酶與酵母 II型轉(zhuǎn)膜定位肽 遺憾的是， YSH577株并未像預(yù)期的那樣在糖基末端有效添加 唾液酸。 巴斯德畢赤酵母糖鏈合成的人源化改造 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 Stephen R. Hamilton et al. Science 313. 1441. 2022 YSH577 rEPO JC308 WT YSH597 b1,NGlcNAc b1,4GlcNAc b1,2GlcNAc b1,4Man a1,6Man a1,3Man a1,2Man b1,4Gal a2,6Sia RDP750 重組巴斯德畢赤酵母分泌的 rEPO的鑒定 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 YSH577 rEPO 重組 rEPO的 HPLC圖譜分析： 重組巴斯德畢赤酵母分泌的 rEPO的鑒定 JC308 WT RDP750 YSH557 YSH597 Y11430 WT YSH551 YSH577 rEPO 重組 rEPO的血細(xì)胞比容分析 ： YSH551株 YSH597株 注射第 8 天 注射第 15天 H 酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的基因工程綜合改造 6 外源基因在酵母中的表達(dá) 化石能源的日益消耗大大促進(jìn)了可再生型生物燃料 （ 如乙醇等 ） 的開(kāi)發(fā)與生產(chǎn) 。 長(zhǎng)期以來(lái) ， 人們普遍關(guān)注的是對(duì)乙醇生物合成基因和耐受基因的遺傳操作 ， 這些努力雖然取得了顯著的進(jìn)步 ， 但似乎觸及了極限 。 釀酒酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的定向改造 在釀酒酵母中 ， 乙醇生物合成基因與其他看家基因一樣 ， 由 RNA聚合酶 II 負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄 。 有證據(jù)顯示 ， TATABOX結(jié)合蛋白的突變會(huì)改變 RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的特異性識(shí)別性質(zhì) ， 進(jìn)而影響眾多不同基因的表達(dá)譜 。 TATABOX TBP TAFs TFIID plex 釀酒酵母轉(zhuǎn)錄機(jī)器的定向改造 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2022 利用易錯(cuò) P C R 技術(shù) 構(gòu)建SPT15的突變文庫(kù) ， 轉(zhuǎn)入釀酒酵母標(biāo)準(zhǔn)單倍體 BY4741株 ， 該單倍體含有內(nèi)源性野生型的 SPT15染色體拷貝 。 當(dāng)篩選壓力增加到 6%的乙 醇和 120g/L的葡萄糖時(shí) ， 獲得 spt15300突變株 ， 它相對(duì)野生株的耐受倍數(shù)達(dá) 13倍 。然后在逐次提高的高濃度乙醇和葡萄糖存在下篩選耐受 突變株。 spt15300突變株的鑒定 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2022 具有優(yōu)良特性的 spt15300突變株包含三個(gè)突變位點(diǎn) ， 它們均集中在TBP的重復(fù)序列 2結(jié)構(gòu)域中 。 spt15300突變株的鑒定 Hal Alper et al. Science 314. 1565. 2022 轉(zhuǎn)錄譜分析結(jié)果表明 ， 在無(wú)壓力的條件下 ， spt15300突變株相對(duì)于野生株 ，展示出數(shù)百個(gè)基因不同程度的表達(dá) ，但大多集中在氧化還原酶 、 胞質(zhì)蛋白質(zhì) 、 氨基酸代謝 、電子傳遞鏈等功能范 圍
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