基因工程原理-第二章dna重組-閱讀頁
2025-01-17 17:53本頁面
【正文】 缺口轉(zhuǎn)移（ nick translation）反應(yīng) —— 用于分子克隆。DNA聚合酶 I的 5’3’ 核酸外切酶活性3’3’5’5’nick3’OH 5’P缺口雙鏈DNA聚合酶 I 的聚合活性3’3’5’5’nick3’OH 5’P切去 1個 5’ 核苷酸在 3’OH 上加上新的核苷酸3’3’5’5’nick3’OH 5’P32P標記的核苷酸DNA缺口轉(zhuǎn)移 —— 線狀分子DNaseI切斷 DNA鏈DNA聚合酶 I 5’3’ 核酸外切酶活性DNA聚合酶 I 的聚合活性形成 1條具有 32P標記的合成 DNA鏈（標記探針）在 5’ 端切去 1個核苷酸切出 1個缺口在 3’OH 加上 1個 32P標記的核苷酸32P標記的核苷酸制備高比活的 DNA探針?25181。g純化的目的基因 DNA片段；?適量的 DNaseI；?DNA聚合酶；?32PdNTPs； dNTPs；典型的反應(yīng)體系：（二）大腸桿菌 DNA聚合酶 I的 Klenow片段與 DNA末端標記Klenow聚合酶的特點：? 分子量： 76103dal? 具有聚合酶的活性? 具有 3’5’的核酸外切酶的活性。dal： MW： 76103枯草桿菌蛋白酶Klenow聚合酶的應(yīng)用：? cDNA克隆中第二鏈合成的催化? 補平雙鏈 DNA的 3’ 凹端。??3’3’A???3’3’32PGA???3’3’32PAGA?32PGTP32PGTP， ? 標記 DNA片段的末端：帶標記的 dNTPDNA序列測定： Sanger末端終止法CGTACCTCGTTCATGACAAGCGTCTCAddGAGTddCGCAGAGTddTGTTCGCAGAGTddACTGTTCGCAGAGT*********Klenow片段（三） T4 DNA聚合酶? 從 T4噬菌體中分離的? 噬菌體基因 43編碼? 具有 5’→3’ 聚合酶活性? 具有 3’→5’ 核酸外切酶活性，是 Klenow片段的 200倍左右。取代反應(yīng)特點：? 當反應(yīng)混合物中沒有 dNTP時， T4DNA聚合酶只有 3’5’核酸外切酶活性，從 3’OH端降解 DNA。32P標記的核苷酸5’5’3’3’A T C G T A C A GT A G C A T G T C5’5’3’3’A T C G T A C C A T G T C5’5’3’3’A T C G T A C A GT A G C A T G T GT4 DNA聚合酶， dGTP具有 3’OH末端的 DNA片段加入 32P dNTPs32P標記的核苷酸逐漸取代了外切酶刪掉的原有核苷酸 —— 取代反應(yīng)。又叫依賴 RNA的 DNA聚合酶，或 RNA指導的 DNA聚合酶。包括：α鏈： 65103dalH活性： H是一種專門切割 DNA與 RNA雜交鏈上 RNA分子的酶RNA模板DNA引物AMVDNARNAAMVAMV —— 催化以 DNA和 RNA為模板 ，以 4種 三磷酸核苷（ATP、 UTP、 CTP、 GTP)為底物，合成一條與模板序列互補的 RNA新鏈的酶
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