第14章基因重組和基因工程_2-閱讀頁
2025-01-17 15:09本頁面
【正文】 工藝學(xué)。磷酸基和 3180。末端 Klenow片段 又名 DNA聚合酶 I大片段，具有完整 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合、 3??5?外切活性，而無 5??3?外切活性。羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針 末端轉(zhuǎn)移酶 在 3180。 GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + Bam HⅠ ? 定義： 目錄 與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng) ， 限制外源 DNA， 保護(hù)自身 DNA。 ? 命名： Hin dⅢ 屬 系 株 序 Haemophilus influenzae d株 流感嗜血桿菌 d株的第三種酶 目錄 Ⅱ 類酶識(shí)別序列特點(diǎn) —— 回文結(jié)構(gòu) (palindrome) 切口 ： 平端切口 、 粘端切口 GGATCC CCTAGG 目錄 Bam HⅠ GTC CAG G CCTAG GATCC G + GGATCC CCTAGG HindⅡ GTCGAC CAGCTG GAC CTG + 平端切口 粘端切口 目錄 來源不同的限制酶 ， 但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn) ， 這些酶稱 同功異源酶 。 這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端 (patible end)。以單鏈 cDNA為模板、經(jīng)聚合反應(yīng)可合成雙鏈 cDNA。 目錄 （四）基因載體 ? 定義 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA分子。 ?表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的克隆載體稱為 表達(dá)載體 。 目錄 (plasmid) 特點(diǎn) : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息 , 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀 。 2. 基因組 DNA文庫 (genomic DNA library) 3. cDNA文庫 (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) (見第 22章 ) 目錄 化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測(cè)可能的 DNA序列。 目錄 （三）外源基因與載體的連接 方式： (1)同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接 配伍末端連接 1. 粘性末端連接 Bam HⅠ 切割反應(yīng) GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。C 重組體 載體自連 目的基因 自連 目錄 在末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal transferase) 的作用下 ， 在 DNA片段末端加上同聚物序列 、 制造出粘性末端 ， 再進(jìn)行粘端連接 。 3180。 5180。 3180。 5180。 3180。 5180。 3180。 5180。 3180。 5180。 A(A)nA A(A)nA 3180。 λ核酸外切酶 λ核酸外切酶 末端轉(zhuǎn)移酶 + dATP 末端轉(zhuǎn)移酶 + dTTP T4 DNA連接酶 15186。 目錄 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接 。 3180。 1. 原核表達(dá)體系 ( ) 大鼠胰島素原 cDNA 的表達(dá)和分泌 目錄 ? 優(yōu)點(diǎn)： 可表達(dá)克隆的 cDNA及真核基因組 DNA 可適當(dāng)修飾表達(dá)的蛋白質(zhì) 表達(dá)產(chǎn)物分區(qū)域積累 ? 缺點(diǎn)： 操作技術(shù)難、費(fèi)時(shí)、經(jīng)濟(jì) ? 轉(zhuǎn)染 —— 將表達(dá)載體導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程 方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染 DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染 電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 （酵母、昆蟲、乳類動(dòng)物細(xì)胞） 表達(dá)載體 pFASTBACI 的物理圖譜 表達(dá)載體 YEpI PT的物理圖譜 目錄 第三節(jié) 重組 DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué) 的關(guān)系非常密切并前景遠(yuǎn)大 DNA Rebination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective 目錄 一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆 根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質(zhì)，而認(rèn)識(shí)疾病的分子機(jī)制。 ?美國(guó) Eli Lilly公司于 1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場(chǎng)，標(biāo)志著生物工程藥物時(shí)代的開始。 目錄 重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品 產(chǎn) 品 功 能 組織胞漿素原激活劑 抗凝 血液因子 VIII 促進(jìn)凝血 顆粒細(xì)胞 巨噬細(xì)胞集落剌激因子 剌激白細(xì)胞生成 促紅細(xì)胞生成素 剌激白細(xì)胞生成 生長(zhǎng)因子 (bFGF, EGF) 刺激細(xì)胞生長(zhǎng)與分化 生長(zhǎng)素 治療侏儒癥 胰島素 治療糖尿病 干擾素 (? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 抗病毒感染及某些腫瘤 白細(xì)胞介素 激活、剌激各類白細(xì)胞 超氧化物歧化酶 抗組織損傷 單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進(jìn)行診斷試驗(yàn)、腫瘤導(dǎo)向治療 乙肝疫苗 (CHO, 酵母 ) 預(yù)防乙肝 口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂 目錄 基因診斷 (geic diagnosis)是 利用分子生物學(xué)及分子遺傳的技術(shù)和原理 ， 在DNA水平分析 、 鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換 、 缺失或插入等突變 。 三、基因診斷與治療 （一）基因診斷的概念 目錄 ?基本過程： 區(qū)分或鑒定 DNA的異常 分離、擴(kuò)增待測(cè)的 DNA片斷 目錄 ? 能正確擴(kuò)增靶基因； ? 能準(zhǔn)確區(qū)分單個(gè)堿基的差別； ? 本底或噪聲低，不干擾 DNA的鑒定 。 ?標(biāo)準(zhǔn)： 目錄 （二）基因治療的概念 ?定義 基因治療 (gene therapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目
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