【正文】 末端稱為 配伍未端(patible end)。命名：Hin dⅢ 屬 系 株 序Haemophilus influenzae d株流感嗜血桿菌 d株的第三種酶Ⅱ 類酶識(shí)別序列特點(diǎn)： —— GGATCCCCTAGG GCCTAG GATCC G+Bam HⅠ作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源 DNA， 保護(hù)自身DNA。羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶 在 3180。末端Klenow片段 又名 DNA聚合酶 I大片段，具有完整 DNA聚合酶 I的 5??3?聚合、 3??5?外切活性，而無 5??3?外切活性。磷酸基和 3180。目的① 分離獲得某一目的基因或 DNA ② 獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程 (geic engineering) —— 實(shí)現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關(guān)的工作，又稱 重組DNA技術(shù)。（一） DNA克隆DNA克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體 DNA接合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子 —— 復(fù)制子 (replicon)，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增提取獲得大量同一 DNA分子，也稱基因克隆或重組 DNA (rebinant DNA) 。1980年 開始建造第一家應(yīng)用重組 DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1997年 英國羅林研究所成功的克隆了多莉一、相關(guān)概念–DNA克隆–工具酶–目的基因–基因載體二、基本原理及操作步驟 本節(jié)主要內(nèi)容一、重組一、重組 DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 克隆 (clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。150bpattUCLC repressor for A, BB 33 kd 與轉(zhuǎn)座有關(guān)A 70 kd 轉(zhuǎn)座酶U, S 毒性蛋白attL, attR 與寄主同源，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)座必需 Gin G區(qū)倒位酶ISIS內(nèi)酰胺酶 regulator38bpIRAmpR kb 20 kbTn10Tn7Tn6Tn5StrR)(AmpRTn4(AmpR)Tn2Marcus . M. Rhoabes 玉米果皮、糊粉層花斑突變 玉米籽粒糊粉層色素不穩(wěn)定遺傳機(jī)理 跳躍基因（ jumping gene）? 1947 冷泉港實(shí)驗(yàn)室（美） Barbara McClintocka) 不依賴 供體序列 與靶位點(diǎn)間序列的同源性b) 轉(zhuǎn)座不是簡單的轉(zhuǎn)移，涉及轉(zhuǎn)座子的復(fù)制Hotspots (熱點(diǎn) )Regional preference ( 在 3kb區(qū)域內(nèi)的隨機(jī)插入 ) d) 某些轉(zhuǎn)座因子（ Tn3）對同類轉(zhuǎn)座因子的插入具有排他性 （免疫性）e) 靶序列在轉(zhuǎn)座因子兩側(cè)會(huì)形成正向重復(fù) f) 轉(zhuǎn)座因子的切除與轉(zhuǎn)座將產(chǎn)生復(fù)雜的遺傳學(xué)效應(yīng)轉(zhuǎn)座重組的特點(diǎn)c) 轉(zhuǎn)座插入的靶位點(diǎn)并非完全隨機(jī) （插入專一型）二、 ? 兩種類型： 簡單轉(zhuǎn)座子（ simple transposon） （插入序列 insertion sequence IS ） 復(fù)合轉(zhuǎn)座子（ posite transposon）? 共同特征： a）兩端有 20～ 40bp的 IR(反向重復(fù)序列 ) b）具有編碼轉(zhuǎn)座酶（ transposase）的基因插入序列（最簡單的轉(zhuǎn)座子稱作插入序列）? 最簡單，是細(xì)菌染色體、質(zhì)粒和某些噬菌體的正常組分? 命名： IS＋編號(hào)（鑒定類型） 長度 700～ 2023bp? 特點(diǎn)： a）兩端 IR為轉(zhuǎn)座酶的識(shí)別位點(diǎn)（突變） b）插入靶位點(diǎn)后會(huì)出現(xiàn)靶位點(diǎn)的正向重復(fù)（ 3～ 9bp）? IS 可以正反方向插入到 DNA（宿主、質(zhì)粒或某些噬菌體）， 常對插入位點(diǎn)后面的基因表達(dá)功能產(chǎn)生極性效應(yīng)a) Tn / TnA family l 具有 IR、轉(zhuǎn)座酶基因、 調(diào)節(jié)基因（解離酶）、抗抗生素基因 rH1為 H1的阻遏蛋白基因。因子接到重組反應(yīng) 原核同源重組的其它蛋白 需要 中三個(gè)基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的產(chǎn)物 a、 RuvA 識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn)b、 RuvB 為分枝遷移提供動(dòng)力（ ATPase 10～ 20bp/s） c、 RuvC 核酸內(nèi)切酶 專一性識(shí)別 Holliday 結(jié)構(gòu)的連接點(diǎn) 體外切段連接點(diǎn)以拆分重組體? 重組的各階段 （損傷修復(fù)）損傷 DNA復(fù)制產(chǎn)生缺口RecA鏈交換第二次鏈交換DNApol通過 DNA合成填滿缺口RuvA,B分枝遷移RuvC切割Holliday連接點(diǎn)真核生物同源重組機(jī)制自學(xué)、位點(diǎn) 專 一性重 組 （ sitespecific rebination）概念： 發(fā) 生在 專 一序列而 順 序極少相同的 DNA分子 間 的重 組 （ 包括一些基因表達(dá)調(diào)節(jié)、發(fā)育過程中 DNA重排）噬菌體基因 組 整合到 細(xì) 菌染色體基因 組 中屬此種重 組特征：? 在特定的結(jié)合序列部位，有專一的酶催化斷裂重接 產(chǎn)生精確的 DNA重排? 都具有整合作用的兩個(gè)基本特征a、 典型的保守性重組 交換是相互的和保存原先的 DNAb、 發(fā)生在噬菌體和細(xì)菌 DNA短同源序列的專一性核苷酸上二、 λ phage的整合與切除（溶原和裂解狀 態(tài) ） 實(shí)現(xiàn) 機(jī)制：均是通過 細(xì)菌 DNA和 λ DNA上特定位點(diǎn)之間的重組特定位點(diǎn) 附著位點(diǎn)（ attachment site att）? attB 含 BOB’三序列 23bp? λphage attP 含 POP’三序列 240bp? 核心序列 “ O” 完全一致 （同源部分） 位點(diǎn)特異性重組發(fā)生的地方? B,B’,P,P’臂整合 過 程? 整合后的附著位點(diǎn)為 attL（ BOP’） attR（ POB’）? 整合位點(diǎn) attB、 attP 切除位點(diǎn) attL、 attR? 整合過程需要 λ 整合酶 （ integrase Int）（ λ 編碼 ） 和 寄主的整合宿主因子 IHF （ integration host factor） 共同作用溶源性細(xì)菌(lysogen)溶菌周期（ lysis）原噬菌體整合分子機(jī)制? 核心序列 O全長 15bp，富含 AT? 發(fā)生在 O內(nèi)的重組交換位點(diǎn)相距 7bp? 整合酶的結(jié)合位點(diǎn)： attP