【正文】 CC TAGCC TAGA TC CGGA TC CG載體自連 目的基因自連 同一限制酶切位點連接 不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAGAATT CCT TAAG AGA TCTTC TAGAEco RⅠ 切割位點 Bg lⅡ 切割位點 AATTC G ATC TAGA ATTCGGATCTAAATTC G ATC TAG+ EcoRⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAT4 DNA連接酶 15186。如果構(gòu)建的目的基因是要表達(dá)的，則要選擇合適的表達(dá)載體。 二、載體的選擇與制備 λ噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫， pUC系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建 cDNA文庫和克隆一些較小的 DNA片段， M13噬菌體則用于克隆一些待測序的 DNA片段。 mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復(fù)制 ? 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR） TA克隆系統(tǒng)由 Invitrogen公司（ San Diego， CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于 PCR產(chǎn)物的克隆和測序。 2. 基因組 DNA文庫 (genomic DNA library) 3. cDNA文庫 (cDNA library) 4. 聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain reaction, PCR) 一、目的基因序列的來源和分離 化學(xué)合成法獲取目的基因 由已知氨基酸序列推測可能的 DNA序列。 ③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地； ④必需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指 多位 Ampr。 ② 在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件， 包括啟動子、增強子、轉(zhuǎn)錄終止和加 polyA信號序列、 mRNA剪接信號序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識別位點等。 原核表達(dá)系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控的啟動子有： Lac(乳糖啟動子 )、 Trp(色氨酸啟動子 )、 Tac(乳糖和色氨酸的雙啟動子 ) 、 λ PL(λ 噬菌體的左向啟動子 )、 T7噬菌體啟動子等。根據(jù)受體細(xì)胞不同，表達(dá)載體多種多樣，如原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體。常用的病毒載體的特點： ? 酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC) ? 細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC) ? 動物病毒 DNA改造的載體 （如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒） . 其他 表達(dá)載體 指用來在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體稱為 表達(dá)載體 。A A V 病毒載體 單鏈 DNA 病毒 ~ 5kb可感染分裂和非分裂細(xì)胞；整合到染色體中；無致病性；免疫原性弱；可長期表達(dá)外源基因；在骨骼肌、心肌、肝臟、視網(wǎng)膜等組織中表達(dá)較高；I n vi vo 基 因 治療；E x vi vo 基因治療；遺傳病基因治療；獲得性慢性疾病的基因治療。 存在的問題： 安全性 靶向性 有效性 細(xì)胞毒性 染色體毒性 免疫毒性 轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性 轉(zhuǎn)錄靶向性 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 靶向性 基因表達(dá)水平和持續(xù)時間 表達(dá)的可調(diào)控性 病毒載體 生物學(xué)特性 適用范圍反轉(zhuǎn)錄病毒載體 單鏈 RNA 病毒 8~ 10kb可感染分裂細(xì)胞；整合到染色體中；表達(dá)時間較長；有致癌的危險；E x vi vo 基因治療；腫瘤基因治療。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒。這類載體的代表是 SV40－ PSV系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒－逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體 pLPGHL、 pMSV 等。 (plasmid) 特點 : 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息 , 會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀 。 ?表達(dá)載體 (expression vector) 為使插入的外源 DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成 多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為 表達(dá)載體 。羥基末端進行同質(zhì)多聚物加尾 堿性磷酸酶 切除末端磷酸基 第二節(jié) 基因克隆需要特定的載體 基因載體 ? 定義 為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用于 cDNA第二鏈合成，雙鏈 DNA 3?末端標(biāo)記等 反轉(zhuǎn)錄酶 ① 合成 cDNA ② 替代 DNA聚合酶 I進行填補，標(biāo)記或 DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸 5180。羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使 DNA切口封合或使兩個 DNA分子或片段連接 DNA聚合酶 Ⅰ ① 合成雙鏈 cDNA分子或片段連接 ② 缺口平移制作高比活探針 ③ DNA序列分析 ④ 填補 3180。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A ? 同尾酶 名 稱 識別序列及切割位點 名 稱 識別序列及切割點 切割后產(chǎn)生５ ’突出末端 : BamHⅠ 5’…G ▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’…A ▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’…G ▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’…A ▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C ▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’… ▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA ▼TATG...3’ 切割后產(chǎn)生 3’突出末端 : Apa Ⅰ 5’…GGGCC ▼C...3’ Hae Ⅱ 5’…PuGCGC ▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC ▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA ▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG ▼C...3’ 切割后產(chǎn)生平末端 : Alu Ⅰ 5’…AG ▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT ▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG ▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG ▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC ▼GGG...3’ 限制性內(nèi)切核酸酶 重組 DNA技術(shù)中常用的工具酶 工 具