基因工程第6章dna重組的操作1-文庫吧資料
2025-01-11 17:55本頁面
【正文】 適。 DNA分子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞制備感受態(tài)細(xì)胞的注意事項(xiàng)1. 細(xì)胞生長狀態(tài)和密度 : l 不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于４ ℃ 的培養(yǎng)菌，最好從 － 70℃ 或 － 20℃ 甘油保存的菌種 中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。 沉淀菌體 冰水浴中預(yù)冷 10分鐘， 4 ℃ 離心216。 三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Ca 2＋ 誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法216。 Ca 2＋ 誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法216。 轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難216。 革蘭氏陰性菌216。感受態(tài)是細(xì)菌的一種遺傳特性，而且也受生長階段、培養(yǎng)條件的影響。 首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象 肺炎鏈球菌（ Griffith,1928） 嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、根瘤菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬、黃單胞菌屬等。轉(zhuǎn)化過程供體（ donor）：提供 DNA的生物受體（ recipient or host）：獲得 DNA的生物l 轉(zhuǎn)化 ：受體菌 直接吸收 供體菌的 DNA片斷而獲得后者部分遺傳性狀的現(xiàn)象 。轉(zhuǎn)化微生物的種類216。 人類疾病的基因治療第二節(jié) 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞 重組質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌 轉(zhuǎn)化（ transformation）216。 動物疫苗216。水稻，棉花，玉米，馬鈴薯，煙草等動物細(xì)胞早期：生殖細(xì)胞、受精卵細(xì)胞或胚細(xì)胞現(xiàn)在：體細(xì)胞培養(yǎng)動物： 豬、羊、牛、魚、鼠、猴等216。 纖維素酶處理－原生質(zhì)體216。 可將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至胞外植物細(xì)胞216。 不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素216。 基因結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一216。 枯草桿菌 人 β干擾素、白細(xì)胞介素 乙肝病毒核心抗原等216。 原核生物內(nèi)源蛋白易降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定常用受體菌：216。 缺乏真核生物蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)216。 多為單細(xì)胞生物，繁殖迅速，過程簡單缺陷：以原核生物表達(dá)真核生物基因存在問題，很多真核生物基因不能在 能蛋白。 沒有核膜，有利于外源片斷重組216。 有較高的應(yīng)用價(jià)值 原核生物細(xì)胞是較為理想的受體細(xì)胞216。 在遺傳密碼的應(yīng)用上無偏倚性216。 安全性高216。 便于重組體的篩選216。 易于重組 DNA分子的導(dǎo)入216。 有些差別條帶成簇出現(xiàn)，造成假陽性216。 12種錨定引物和 20種隨機(jī)引物， 240次 PCR216。 可同時(shí)展現(xiàn)所有差異216。 幾乎可檢測細(xì)胞表達(dá)的所有基因216。l 這種 5 ’隨機(jī)引物可以同特定細(xì)胞類型的總mRNA群體中的一部分分子發(fā)生雜交作用，而且雜交部位是隨機(jī)地分布在距每條新合成的cDNA鏈 3’端的不同位置上。這一過程叫做 差異顯示反轉(zhuǎn)錄 ，即 DDRT。3 ’端錨定引物l 錨定引物的通式是 oligo(dT)12MN，其中 M為 A、C、 G中的任意一種， N為 A、 C、 G或 T中的任意一種，所以 共有 12種 oligo(dT)12MN引物，用這 12種引物分別對同一總 RNA樣品進(jìn)行 cDNA合成 ，即進(jìn)行 12次不同的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，每一種 3 ’端錨定引物，都能夠把總 mRNA群體的 1／ 12分子反轉(zhuǎn)錄成 mRNAcDNA雜交分子。五、 mRNA差別顯示技術(shù)l 又稱為差別顯示反轉(zhuǎn)錄 PCR（ DDRTPCR）l 目的序列未知， 1992年由美國哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)分校 DenaFarber研究所的兩
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