【正文】 步驟： ①合成核酸探針（與所需基因互補(bǔ)的核苷酸短鏈，并用同位素標(biāo)記） ②升高溫度或改變 pH使 DNA變性 ③分子雜交（常用原位分子雜交）如果基因文庫中的一個 DNA片段能和探針結(jié)合形成雙鏈，這一片段即含有所需基因。 凝膠電泳檢測 加樣孔 DNA Marker 空質(zhì)粒 重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒酶切 重組質(zhì)粒的 PCR擴(kuò)增片段 PCR法 利用的目標(biāo)引物 (例如分離目的基因所使用的引物 )，抽提需要篩選的克隆的重組 DNA作為模板 , 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增 ,根據(jù)是否擴(kuò)增出目的片段來確定陽性克隆。 α互補(bǔ)法 限制性酶切法 經(jīng)過粗篩后的含重組體的細(xì)菌，還需進(jìn)行限制酶譜分析進(jìn)一步鑒定。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。 Xgal本身是無色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無色的半乳糖及深蘭色的 5溴 4氯靛蘭），因此會形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源基因插入時，在 IPTG （異丙基硫代 βD半乳糖苷）誘導(dǎo)下合成 β－半乳糖苷酶 N端片斷，和受體菌的 C端片斷溶為一體后，可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補(bǔ)，形成有活性的 β－半乳糖苷酶，稱 α互補(bǔ)。這個編碼區(qū)中插入一個多克隆位點(diǎn)。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長的細(xì)菌即為帶重組體的細(xì)菌。 對于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用 插入滅活法 進(jìn)行篩選。 ? 多聚物介導(dǎo)法： 利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（ DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價陽離子、 DNA混合形成沉淀顆粒，通過細(xì)胞的胞飲作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 ? 顯微注射法： 利用毛細(xì)管直接將 DNA注入細(xì)胞內(nèi)。 磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 重組體 + 磷酸鈣微粒 內(nèi)吞作用 重組體進(jìn)入細(xì)胞 大顆粒 轉(zhuǎn)染方法 ? 基因槍轉(zhuǎn)染法： 利用被電場或機(jī)械加速的金屬微粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基本原理，先將 DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使 DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。將這些沉淀加入到細(xì)胞中，利用細(xì)胞的胞飲作用將 DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。 ? 磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)：主要用于動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。 對照實(shí)驗(yàn) ? ：在高壓電場下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。當(dāng)所轉(zhuǎn)化的ＤＮＡ很難得時（如用從相對難得的樣品中提取 mRNA而合成的 cDNA),這就顯得格外重要。 ? 轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源 DNA的量過多或體積過大時 ,轉(zhuǎn)化效率就會降低。 ? 計(jì)算轉(zhuǎn)化率。 ? 向管中加入 1ml LB液體培養(yǎng)基 (不含 Amp)，混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1小時，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài) ,并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因 (Ampr )。 ? 加入 pBS質(zhì)粒 DNA溶液 (含量不超過 50 ng,體積不超過 10μl)，輕輕搖勻，冰上放置 30分鐘后。 ? 防止雜菌和雜 DNA的污染：整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行 , 所用器皿 , 如離心管 , tip頭等經(jīng)高壓滅菌處理 ,所有的試劑都要滅菌 ,且注意防止被其它試劑、 DNA酶或雜 DNA所污染 , 否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜 DNA的轉(zhuǎn)入 , 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化效率。細(xì)胞生長密度以剛進(jìn)入對數(shù)生長期時為好，可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的 OD600 來控制。 ? 感受態(tài)細(xì)胞分裝成 200μl的小份 ,貯存于 70℃ 可保存半年。 ? 棄去上清 ,用預(yù)冷的 mol/L的 CaCl2 溶液 10ml輕輕懸浮細(xì)胞 ,冰上放置 1530分鐘后， 4℃ 下 3000 g離心 10分鐘。將該菌懸液以 1:1001:50的比例接種于 100ml LB液體培養(yǎng)基中， 37℃ 振蕩培養(yǎng) 23小時至 OD600 ＝ 。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備 ( 化學(xué)方法 ) 大腸桿菌細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 CaCl2處理 目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法是 CaCl2法 , CaCl2 法簡便易行 ,且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求 ,制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時不用時 ,可加入占總體積 15％的無菌甘油于 70℃ 保存(半年 ),因此 CaCl2法為使用更廣泛。 ? 如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA。 ? 載體酶切回收是否考慮到切除片段的大小， ? 是否要用切膠回收更保險。 連接體系的建立： ? 溫度：粘末端連接： 1218℃ (1620 hours) 平末端連接：室溫（低于 30℃ ) ? DNA量：載體分子數(shù) /目的基因分子數(shù) =1： 35 ? 酶量：平端連接時需加大酶量 連接反應(yīng)體系越小越好，相對而言，酶切體系稍大較好 連接失敗后 ? 一步一步向上游檢測問題所在，所以分子 克隆部分 “留一半 ”的原則有時候是很有用的。 （三）人工接頭連接法： ? 將人工連接器（ linker，即一段人工合成的含有多種限制酶切點(diǎn)的小分子 DNA片段，約 10~20個核苷酸）連接到平末端 DNA分子 (載體和目的基因 )上，即有可能使用同一種限制酶對載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。 末端轉(zhuǎn)移酶（ terminal transferase） 該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（ terminal deoxynucleotidyl transferase），它所催化的反應(yīng)與DNA pol I 相似，所不同的是它不需要模板，它可以含有３’－ＯＨ的ＤＮＡ片段為引物，在３’－ＯＨ端加入核苷酸達(dá)幾百個。 ? 此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的 339。 載體 DNA與目的基因的連接 （二）人工接尾法： ? 即同聚物加尾連接法。 ? 較少的情況下，對產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。 Tvector Tvector兩條鏈的 5’端含有一個游離的 T PCR過程中，普通的 Taq酶可在產(chǎn)物的 3’端多加一個 A DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 接 載體和目的基因的連接 （一）粘性末端連接法： ? 當(dāng)載體 DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時，二者即可帶有相同的粘性末端。 不能時間過長，以防止內(nèi)切酶的 s