【文章內(nèi)容簡介】 。(3)疫苗制備痘苗病毒載體已廣泛用于外源基因的表達調(diào)控研究，逐步成為常規(guī)表達外源蛋白的工具。利用痘苗病毒載體進行疫苗開發(fā)研究主要有如下兩個大的方面。首先，利用痘苗病毒表達外源基因生產(chǎn)多肽或亞單位疫苗。由于疫苗病毒表達的外源蛋白，比細菌、酵母及多角體病毒表達系統(tǒng)更接近天然結(jié)構(gòu)，病毒穩(wěn)定性好，增殖滴度高，宿主范圍廣，便于操作，且價廉容易生產(chǎn)。因此，如何構(gòu)建和利用高效表達痘苗病毒載體系統(tǒng)成為表達外源基因的關(guān)鍵一步。其次，利用痘苗病毒載體進行重組活疫苗的研究。由于重組痘苗病毒不僅誘導機體產(chǎn)生體液免疫，而且誘導堅強的細胞免疫。痘苗病毒作為基因重組活疫苗載體，不需佐劑即可免疫動物，病毒在體內(nèi)增殖過程中產(chǎn)生的外源蛋白可剌激機體產(chǎn)生免疫反應。表達的外源蛋白在細胞內(nèi)被修飾后，與自身的組織相容性復合體(MHC)結(jié)合，剌激CD+8T淋巴細胞(細胞毒性T淋巴細胞)。重組痘苗病毒已用于人類疾病的臨床研究，有些重組痘苗病毒活疫苗已處于免疫觀察階段。在北歐，從1989年起野外投放狂犬痘苗重組病毒3次，到了1990年后半葉投放區(qū)野生狐貍及其周圍家畜，已無狂犬病發(fā)生。猴免疫缺陷病毒(SIV)痘苗重組病毒接種猴體后可抵抗強毒的攻擊。HIV1痘苗重組病毒接種人體，亦已進入臨床試驗階段。痘苗病毒在基因重組活疫苗研究中的優(yōu)點之一，是可進行多價基因重組疫苗的制備。由于痘苗病毒的基因組容量大，可插入25Kb的外源基因而不影響自身復制。因此，可將不同的外源基因，特別是各種病毒保護性抗原基因一同插入痘苗病毒基因進行表達。這種嘗試已有成功的報道?？傊?，痘苗病毒無致癌性，穩(wěn)定性好，宿主范圍廣，基因組容量大，非必需區(qū)多，能誘發(fā)機體產(chǎn)生堅強的體液免疫和細胞免疫等都是其突出的優(yōu)點。雖然存在百萬分之一的種痘后腦炎和全身性發(fā)痘，但隨著對其基因組結(jié)構(gòu)、功能的深入研究和改造，必將成為分子生物學、基因工程生物活性物質(zhì)生產(chǎn)、基因重組疫苗及多價疫苗研究的有效工具。圖3—7克隆的痘苗病毒天壇株DNAHindⅢ片段凝膠電泳圖（a）及放射自顯影圖（b）表3—2痘苗病毒天壇株HindⅢ片段大?。╧b數(shù)）與其它痘苗毒株的比較Mackett等（1979）Panicali等（1981）侯云德（1985）DIEHILSWRWRLWRS天壇株761~~—~—P—————Q—　　　—　　　　　—　　　　—　　　　—　　　　　　—表3—3痘苗病毒天壇株XhoI片段大?。╧b數(shù)）與其它痘苗毒株的比較Mackett等（1979）Panicali等（1981）侯云德（1985）DIEHILSWRWRLWRS天壇株761~~2—2—2————N——————表3—4痘苗病毒天壇株HindⅢHindⅢ酶切片段克隆號DaDbEFaFb175285759155559441778166688135254940710639755963限制酶44084039675872177585415274738905751329659937842* *Kb數(shù)此外，天壇株與WR株的F片段的13個酶譜分析表明，其中有5個酶切點的差異，而且這些變異集中在F啟動子的附近（圖3—8）。圖3—8痘苗病毒天壇株與WR株F片段酶譜分析圖WRF：WR株F片段；TTFa和Fb：天壇株Fa亞型與Fb亞型片段。金奇等（1988）就天壇株的約25kb核苷酸序列進行了測定和分析，%的差異（表3—5）。表3—5痘苗病毒天壇株與WR株在核苷酸水平上差異的比較蛋白編碼區(qū)位置**轉(zhuǎn)錄時間核苷酸變異同義變異異義變異轉(zhuǎn)換顛換(%)(%)(%)(%)(%)胸苷激酶（TK）小亞基大亞基抗α—鵝膏早期宿主范圍（hr）*血凝素（HA）小亞基蛋白*與Coppenhagen株比較。**L、J、I、N、M、K、F、E分別代表HindⅢ酶切片段。（五）痘病毒變異株目前所知有如下幾種：胸腺嘧啶核苷激酶（TK）是一種嘧啶旁路代謝的酶類，它可促使胸腺嘧啶核苷磷酸化，形成5’單磷酸胸腺嘧啶核苷。在真核和原核細胞內(nèi)均有這種酶類。早在1964年，Dubbs就發(fā)現(xiàn)，當TK—細胞感染痘苗病毒后，胞漿內(nèi)的TK活性增加了。采用在5’溴去氧尿苷的壓力下，很易選擇出TK—變異株。采用體外翻譯和標記拯救方法證明，痘苗病毒TK基因位于HindⅢJ片段中（Hrubyetal1981。Weiretal1982），TK全基因也已經(jīng)進行了序列分析（Hrubyetal1983。Weiretal1983。金奇1988）。TK基因常用作基因工程的一種選擇性標記（詳見下節(jié)）。在TK基因部位插入外源基因的重組痘苗病毒，可以表達外源基因而不影響病毒的繁殖。Weir等（1983）對3株自發(fā)的TK變異株的TK基因編碼區(qū)進行了序列分析，并與野毒株進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株TK—變異株都是由于一個核苷酸的重復引起移碼而造成的（圖3—9）。圖3—93株TK—變異株的部分序列WT：痘苗病毒（WR）株的野毒株；TK—120為TK—變異株。（引自Weiretal1983）不論是化學誘變還是插入滅活產(chǎn)生的TK—毒株，對小鼠、家兔和猩猩的毒力都有明顯下降（Bulleretal1985）。ts變異株是病毒株天然變異的一種常見形式。在痘苗病毒中存在大量的ts變異株（Chernosetal1978。Dalesetal1978。Drillienetal1982。Ensinger1982）。兔痘病毒中也存在ts變異株（Lakeetal1980。Sambrooketal1966）。Drillien等（1983）采用克隆基因片段標記拯救的方法，對屬于17個互補組的33株痘苗病毒ts變異株進行了基因定位（圖3—10）。結(jié)果說明，所有ts變異株的基因損害部位均集中在中央保守區(qū)，從HindⅢE至SalIJ,大約60%的基因組內(nèi)。沒有一個ts株基因定位于外側(cè)片段HindⅢF、HindⅢk、SalIC、SalIF或SalⅡ之內(nèi)。但是，Condit等（1983）和Ensinger等（1983）報告，有的ts株基因定位于HindⅢF內(nèi)。ts株的基因定位集中在中央保守區(qū)，這同時說明中央保守區(qū)內(nèi)含有病毒繁殖的主要功能。圖3—10痘苗病毒ts變異株基因損害部位定位圖虛線表示HindⅢ切點，實線為SalI切點，水平粗線表示用于標記拯救的基因片段。阿拉伯數(shù)字表示采用每個基因片段拯救出的變異株數(shù)目。（。）Ensinger等（1983）也是采用基因克隆片段標記拯救的方法，把屬于4個互補組的8株ts變異株的基因定位于HindⅢL、J和H片段。他們（1985）又進一步采用痘苗病毒HindⅢL、J、H片段的次級克隆（12個片段）進行標記拯救試驗，根據(jù)定位部位DNA序列的開放讀碼框架及RNA轉(zhuǎn)錄物，可以確定1~2個多肽為每個變異株的ts基因產(chǎn)物（圖3—11）。圖3—11痘苗病毒ts株的基因定位、轉(zhuǎn)錄物及開放讀碼框架上端為痘苗病毒DNAHindⅢL、J片段以及部分HindⅢH片段。（A）根據(jù)HindⅢL和J片段序列分析確定的開放讀碼框架（Plucienniczaketal1985），轉(zhuǎn)錄方向為左→右，但FF11則為右→左；(B)mRNA轉(zhuǎn)錄物的位置（Bajszaretal1983。Hrubyetal1983。Mahretal1984a,b。Weiretal1984）,粗線為晚期mRNA，虛線為3’端不均一區(qū)段。（C）ts基因定位。（引自Ensingeretal1985）、p或uhr變異株正痘病毒在雞胚絨毛尿囊膜（CAM）上生長時，有的可以產(chǎn)生潰爛的病灶或痘斑，中央有出血呈紅色，稱紅痘。有1%左右的野毒株可以產(chǎn)生白的非潰爛的病灶，稱為白痘（Gemmelletal1960）。這種白痘在牛痘病毒（Downieetal1952）、家兔痘病毒（Gemmelletal1960。Fenneretal1966）、嗜神經(jīng)性痘苗病毒（Fenner1958）和猴痘病毒（Gispenetal1972）均有報道。這種白痘變異株以“U”或“u”表示，相對應的野毒株則為u+。在u變異株中，凡不能在PK細胞中繁殖者則以“p”或“hr”表示，相對應的野毒株則為p+。這樣，野毒株為u+、p+，u變異株則為u、p+，p變異株則為u、p。牛痘病毒（Archardetal1979,1984）、猴痘病毒（Dumbelletal1980。Espositoetal1981）和兔痘病毒（Lakeetal1980。Moyeretal1980a,b）的u或p變異株的酶譜分析表明，在其基因組的兩端有缺失（圖3—12）。在兔痘病毒變異株，左右兩端DNA各缺失10和20MD，如果這些缺失區(qū)段相加可長達30MD，相當于整個DNA的25%。它們對于病毒在某些細胞上的繁殖是非必需的（Moyeretal1980b）。兔痘病毒DNA左臂缺失，右臂不缺失可影響u變異株在豬腎（PK—15）和兔角膜（RC—60）細胞上的繁殖。某些兔痘u變異株，腦內(nèi)接種小鼠和皮內(nèi)接種家兔時，其毒力下降（Gemmelletal1960）。毒力下降與基因組右臂的缺失有關(guān)（Lakeetal1980）。兔痘病毒u表型變異株的基因缺失可發(fā)生在左或右臂，但牛痘和猴痘病毒則發(fā)生在右臂。痘苗病毒DNA可在其左臂有大段缺失，如WR—6/2株雖能在BS—Cl、HeLa和PK—15細胞中正常繁殖，但是，在腦內(nèi)和腹腔內(nèi)接種小鼠時，其毒力卻降低（圖3—12）。圖3—12正痘病毒u變異株的基因缺失圖（HindⅢ切點）（引自Marketal1985）痘苗病毒DNA左端缺失大約18kb（包括EcoRIK、J和大部分C片段）便不能在人細胞上繁殖，如果補充EcoRIK片段則可恢復，說明EcoRIJ和大部分C片段可以缺失，不影響其在人細胞上的繁殖性能（Gillarderetal1985）。Paoletti等（1985）證明，在此區(qū)段插入外源基因或丟失，不致影響痘苗病毒的感染性（圖3—13）。圖3—13痘苗病毒變異株的非必需區(qū)（引自Paolettietal1985）Esposito等（1981）在猴痘病毒中還發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。他們比較了4株病毒DNA：COPE株，系產(chǎn)生出血性痘斑的猴痘病毒Copenhagen株；CpCR株，系從COPE株隨機選擇的紅痘株子代；CpCWN1和CpCWN2株，是從CpCR株選擇的u變異株。結(jié)果表明：CpCR的右末端含有一段左末端的倒置序列，這段倒置序列是通過轉(zhuǎn)位去修復在COPE株DNA中可能的缺失的。CpCW—N1與CpCR株的酶切點相同；而CpCW—N2是CpCR右末端缺失變異株（圖3—14）。圖3—14猴痘病毒幾種變異株DNA的酶切圖（引自Espositoetal1981）金奇等（1988）、Boursnell等（1988）發(fā)現(xiàn)，HindⅢK片段編碼的K1蛋白，由369個氨基酸組成，是絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serineproteaseinhibitor）超家族的成員（Serpin）。Kotwal等（1988）又發(fā)現(xiàn)，在HindⅢB片段的右端重復編碼兩個serpin。病毒serpin編碼區(qū)的缺失與白斑變異株的形成有關(guān)。Bolden等（1975）、Citarella等（19972）發(fā)現(xiàn)，痘苗病毒DNA多聚酶可被PAA（Phosphonoacetate）(磷羧乙酸)所抑制。Overby等（1977）證明，在高濃度PAA的條件下病毒的繁殖受到部分抑制。隨后Condit等（1981）分離出對PAA有抵抗的變異株，稱為PAAr變異株。Moss等（1982）證明，從PAAr毒株分離純化的DNA多聚酶的確對PAA有抵抗。PAAr毒株的這一特征可以作為標記拯救的表型特征。Jones等（1984）利用這一表型特征進行標記拯救，結(jié)合體外翻譯，確定了痘苗病毒DNA多聚酶基因位于HindⅢE片段右側(cè)端2kb的EcoRI—ClaI片段內(nèi)。PAA變異株的基因本質(zhì)尚未闡明。（六）痘病毒基因組的多肽編碼圖痘病毒基因組約有180~200kb或120~132MD，編碼大約150~200個多肽。它編碼的多肽可以分成3類：⑴立即早期蛋白，即痘病毒感染后4hrs內(nèi)，在加環(huán)已亞胺或吐根堿抑制蛋白合成的情況下表達的多肽；⑵早期蛋白，指痘病毒感染后4hrs內(nèi)，在阿糖胞苷抑制DNA合成條件下表達的多肽；⑶晚期蛋白，指痘病毒感染后6hrs，在無任何代謝抑制物存在的條件下表達的多肽。立即早期和早期蛋白主要是有關(guān)病毒復制的酶類，晚期蛋白主要是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。確定病毒DNA的多肽編碼圖的方法，主要是采用克隆的基因片段與從受染細胞中提取的立即早期RNA、早期RNA或晚期RNA進行雜交，然后再將雜交的相應RNA洗脫出來，在無細胞翻譯系統(tǒng)、35S甲硫氨酸存在的條件下，翻譯出相應的蛋白，在SDS—PAGE上進行檢測，這一技術(shù)稱為雜交翻譯法。要確定單一多肽的基因定位，還要進一步縮小克隆的基因片段進行雜交翻譯，結(jié)合功能檢測、S1雙鏈保護試驗、序列分析等才能最后闡明單一多肽的基因定位與結(jié)構(gòu)（詳見下節(jié)）。Cooper等（1978，1979a,b，1981）、Chipchase等（1980）、Cabrera等（1978）和BelleIsle等（1981），相繼采用上述方法研究了痘苗病毒基因組的多肽編碼圖。早期蛋白大約有101個，晚期蛋白大約有47個。早期蛋白中大部分是立即早期蛋白，L片段中無立即早期RNA。晚期蛋白編碼區(qū)集中在基因組中央?yún)^(qū)，特別是HindⅢG、L、J、H和D片段。C’、N、M和K片段中未見晚期蛋白編碼區(qū)；F、E、O片段中有少量晚期蛋白編碼區(qū)。編碼的多肽從6~110KDA不等（表3—6）。表3—6痘苗病毒基因組的初步翻譯圖譜HindⅢ片段CNMKFEOIGLJHDAB總計MW(MD)（七）痘苗病毒基因組表達調(diào)節(jié)的特點痘苗病毒的基因組很復雜。目前，大部分基因組的一級結(jié)構(gòu)已經(jīng)闡明（金奇198