【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 菌株篩選方法 取土樣，稀釋10倍，置于80℃水浴鍋中加熱30min，以去除不產(chǎn)芽孢的菌體。搖床振蕩，使土壤顆粒被打散，混合均勻，用無菌水將上述溶液稀釋成101010106梯度，各取200μL均勻涂布于乳糖篩選平板上， 35～40℃培養(yǎng)20～28小時(shí)。 分離純化培養(yǎng)后，挑取不同形態(tài)的藍(lán)色菌落，通過平板劃線進(jìn)行分離純化，重復(fù)三次；對(duì)分離菌株進(jìn)行培養(yǎng)形態(tài)觀察和鏡檢，確定純培養(yǎng)。 菌種生理生化鑒定在細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)所篩菌株進(jìn)行初步的生理生化鑒定。 β半乳糖苷酶粗酶液制備將純化菌株按體積分?jǐn)?shù)為1％的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)好的菌液以5000r/min離心10 min，棄掉上清液．沉淀經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌后，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎。裂解后的菌液在4℃下以12000r/min離心10min，收集上清液，即為粗酶液。 鄰硝基苯酚（ONP）標(biāo)準(zhǔn)曲線用檸檬酸Na2HPO4緩沖溶液()配制 5mmol/ml 鄰硝基苯酚（ONP）。取 7 支試管分別吸取 0，， ， ， ， ， ， ， ， 5mmol/ml ONP，補(bǔ)上述緩沖液至 ，然后 40℃保溫15min，加入 2mL ，1mol/LNaCO3，以第一管為空白，于 420nm 測(cè)定吸光度，以 ONP 的量為橫坐標(biāo)，以 A420 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 β半乳糖苷酶酶活力測(cè)定 mol/L鄰硝基苯βD半乳吡喃糖苷(ONPG)的0．05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為6．5)混勻，37 ℃反應(yīng)10 min后， mol/L的Na2CO3終止液靜置5 min，于420 nm比色測(cè)定生成鄰硝基苯酚(ONP)濃度。1個(gè)酶活性單位(u)定義為在37℃下每分鐘分解出1μmol ONP所需的酶量。 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 菌種生長(zhǎng)曲線測(cè)定在篩選平板上挑一單菌落接種于裝液量30 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37℃、225r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，分別于0、1123460h取樣。每個(gè)處理重復(fù)3次。以未接種的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為空白對(duì)照。測(cè)定菌液的吸光度OD595 (即生物量)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)；OD595為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)物線。 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響將種子菌液以2％的比例接種到裝有30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中．在37℃、225 r/min的條件下培養(yǎng)，分別于0、1123460 h取樣，每個(gè)處理重復(fù)3次，測(cè)定生物量和酶活性并繪制曲線。 接種量對(duì)菌株BGJ222產(chǎn)酶能力的影響 、、、％的比例接種到裝有30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，于37 ℃、225 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h取樣測(cè)定β半乳糖苷酶表達(dá)量，每個(gè)處理重復(fù)3次。 pH值對(duì)β半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響，確定pH值對(duì)β半乳糖苷酶活力的影響。緩沖液分別為醋酸鈉(，)、磷酸鈉(，)和Tris—HCl(，)，相對(duì)酶活用百分比來表示。將β半乳糖苷酶在上述緩沖液中37℃保溫2 h和24h后，測(cè)殘留的酶活力，分析pH值對(duì)β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。 溫度對(duì)β半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響測(cè)定β半乳糖苷酶粗酶液在不同溫度(溫度范圍為2575℃)時(shí)的酶活力，確定溫度對(duì)β半乳糖苷酶活力的影響。 mol/L磷酸鈉緩沖液()混勻后，分別在30，40，50，和60℃保溫4 h，每隔1 h測(cè)一次殘留的酶活，分析溫度對(duì)β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。 不同金屬離子及離子濃度對(duì)β半乳糖苷酶的影響 mol/L磷酸鈉緩沖液()混勻，并添加各種不同的金屬離子(K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Zn2+和Fe3+)，于37℃測(cè)定酶活。東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文第3章 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 高產(chǎn)β半乳糖苷酶細(xì)菌的篩選用土壤為樣本，以乳糖為唯一碳源，篩選出乳糖利用菌株。菌種純化后測(cè)定其β半乳糖苷酶水解活性，得到酶活較高的菌株8株。表1 列出了篩選獲得的9株菌的β半乳糖苷酶水解活性的測(cè)定結(jié)果。表31 10株β半乳糖苷酶水解活性菌株編號(hào)特征描述OD420酶活（U/mL） 1乳白偏黃，半透明，邊緣圓滑不規(guī)則，菌落中等大小2乳白色，幾乎不透明，邊緣圓滑，菌落很小3乳白色，半透明，邊緣圓滑，菌落中等大小4乳白色，半透明，邊緣圓滑，菌落很小5微紅，半透明，邊緣圓滑，菌落中等偏小6乳白色，半透明，邊緣圓滑，菌落較大7玫瑰紅色，不透明，邊緣分枝狀，菌落中等偏小8淡黃色，半透明，邊緣圓滑，菌落中等偏小從上表中可看出，1號(hào)菌株的酶活性最高，所以選擇1號(hào)菌株作為實(shí)驗(yàn)用菌株。根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)，初步判斷其為枯草芽孢桿菌。 鄰硝基苯酚（ONP）標(biāo)準(zhǔn)曲線圖32 鄰硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝+，R2= 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定由圖33可見，單菌落生長(zhǎng)經(jīng)過6 h的遲緩期后，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，12 h后達(dá)到穩(wěn)定期，生長(zhǎng)到60 h后由于營(yíng)養(yǎng)的耗盡以及環(huán)境pH變化和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌代謝旺盛、酶活性高而且穩(wěn)定，菌體大小比較一致。菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為培養(yǎng)的第l0小時(shí)左右。因此，以下試驗(yàn)均采用單菌落培養(yǎng)10 h的菌液作為種子菌液。圖33 菌株生長(zhǎng)曲線 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響由圖34可見，菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中經(jīng)過2 h的延緩期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)過4 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后，進(jìn)入平緩期。β半乳糖苷酶在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期表達(dá)量很低，進(jìn)入平緩期后β半乳糖苷酶開始大量表達(dá)。培養(yǎng)24 h時(shí)β半乳糖苷酶的表達(dá)量達(dá)到高峰，為860，之后逐漸下降，整個(gè)過程呈現(xiàn)出典型的“S”型。所以，在以下試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間均設(shè)定為24 h時(shí)取樣。圖34 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力影響 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響由圖35可見，隨著接種量的增加，β半乳糖苷酶表達(dá)量逐漸增加，％時(shí)達(dá)到最高．以后又隨著接種量的增加β半乳糖苷酶表達(dá)量逐漸降低。接種量太小，菌的生物量不足，對(duì)產(chǎn)酶不利，接種量太大，營(yíng)養(yǎng)不足，同樣會(huì)影響酶的表達(dá)量。％效果最佳。圖35 接種量對(duì)產(chǎn)酶能力的影響 pH對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響pH值對(duì)酶催化反應(yīng)的影響分別為影響酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物效率以及酶的穩(wěn)定性。～，結(jié)果如圖331所示。由圖332可以看出。β半乳糖苷酶37℃保溫24 h后仍有80％的活力。圖361 pH對(duì)酶活性的影響圖362 pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響 溫度對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響從圖371可以看出，酶的最適溫度在35℃左右，40℃時(shí)仍能保持90%以上活力，40℃之后酶活開始下降，60℃時(shí)只剩30%左右。由圖372可以看出，在30 ℃和40℃時(shí)，保溫處理4 h后仍有85％酶活力。圖371 溫度對(duì)酶活的影響圖372 溫度對(duì)酶的穩(wěn)定性的影響同金屬離子及離子濃度對(duì)β半乳糖苷酶的影響結(jié)果如表38所示。由表38可以看出．在各種金屬離子中，K+、Na+、Mn2+和Mn2+在適當(dāng)濃度范圍內(nèi)對(duì)β半乳糖苷酶酶活有促進(jìn)作用，但隨著濃度增加，促進(jìn)作用減弱或變成抑制，其中Mg2+對(duì)β半乳糖苷酶活力的促進(jìn)效果最明顯，當(dāng)添加濃度為10 mmol/L的Mg2+時(shí)，％。Fe2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+和Cu2+對(duì)β乳糖苷酶酶活有抑制作用，且隨濃度增加抑制作用加強(qiáng)，其中Cu2+的抑制作用最強(qiáng)。在反應(yīng)液中加入濃度為1mmol/L Cu2+后，β半乳糖苷酶即失去活力。表38 金屬離子對(duì)酶活性影響試劑相對(duì)酶活100%1mmol/L10mmol/L100mmol/L空白對(duì)照Fe3+ndFe2+K+Na+Mn2+Mn2+Ca2+ndZn2+ndndCu2+ndndnd注：nd表示酶的相對(duì)活性低于5%，可忽略不計(jì)。第4章 酶的固定化研究酶是由生物體產(chǎn)生的具有催化活性的蛋白質(zhì)，它能特定地促成某個(gè)化學(xué)反應(yīng)而本身卻不參加反應(yīng)，具有催化效率高，條件溫和，反應(yīng)產(chǎn)物污染小，能耗低，反應(yīng)容易控制等特點(diǎn)。這是任何無機(jī)催化劑都無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。但因?yàn)槊傅幕瘜W(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其最大弱點(diǎn)是不穩(wěn)定性，對(duì)酸、堿、熱及有機(jī)溶液容易發(fā)生酶蛋白的變性作用，從而降低或失去活性。而且酶往往在溶液中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)以后會(huì)殘留在溶液系統(tǒng)中不易回收，造成最終產(chǎn)品生化分離提純操作上的麻煩。加之酶反應(yīng)只能分批進(jìn)行，難于連續(xù)化、自動(dòng)化操作。這大大地阻礙了酶工程的發(fā)展應(yīng)用。為克服上述缺點(diǎn)，要將游離酶固定化后進(jìn)行應(yīng)用。固定化酶技術(shù)是把從生物體內(nèi)提取出來的酶，用人工方法固定在特定的載體上。由于固定化酶的運(yùn)動(dòng)被化學(xué)或物理的方法限制了，能將其從反應(yīng)介質(zhì)中回收，所以它原則上能在批量操作或連續(xù)操作中重復(fù)使用。固定化酶是用物理的或化學(xué)的方法使酶與水不溶性大分子載體結(jié)合或把酶包埋在水不溶性凝膠或半透膜的微囊體中制成的。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復(fù)多次使用。便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動(dòng)化生產(chǎn)。固定化酶是近十余年發(fā)展起來的酶應(yīng)用技術(shù)，在工業(yè)生產(chǎn)、化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有誘人的應(yīng)用前景[14]。固定化酶的研究始于 1910 年，正式研究于 20 世紀(jì) 60 年代，70 年代已在全世界普遍開展。酶的固定化 (Immobilization ofenzymes)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi)，仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，