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正文內(nèi)容

β半乳糖苷酶酶活性酶的固定化畢業(yè)論文(編輯修改稿)

2024-07-21 19:16 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 菌株篩選方法 取土樣,稀釋10倍,置于80℃水浴鍋中加熱30min,以去除不產(chǎn)芽孢的菌體。搖床振蕩,使土壤顆粒被打散,混合均勻,用無菌水將上述溶液稀釋成101010106梯度,各取200μL均勻涂布于乳糖篩選平板上, 35~40℃培養(yǎng)20~28小時(shí)。 分離純化培養(yǎng)后,挑取不同形態(tài)的藍(lán)色菌落,通過平板劃線進(jìn)行分離純化,重復(fù)三次;對(duì)分離菌株進(jìn)行培養(yǎng)形態(tài)觀察和鏡檢,確定純培養(yǎng)。 菌種生理生化鑒定在細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,對(duì)所篩菌株進(jìn)行初步的生理生化鑒定。 β半乳糖苷酶粗酶液制備將純化菌株按體積分?jǐn)?shù)為1%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,37℃靜置培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)好的菌液以5000r/min離心10 min,棄掉上清液.沉淀經(jīng)預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌后,在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎。裂解后的菌液在4℃下以12000r/min離心10min,收集上清液,即為粗酶液。 鄰硝基苯酚(ONP)標(biāo)準(zhǔn)曲線用檸檬酸Na2HPO4緩沖溶液()配制 5mmol/ml 鄰硝基苯酚(ONP)。取 7 支試管分別吸取 0,, , , , , , , , 5mmol/ml ONP,補(bǔ)上述緩沖液至 ,然后 40℃保溫15min,加入 2mL ,1mol/LNaCO3,以第一管為空白,于 420nm 測(cè)定吸光度,以 ONP 的量為橫坐標(biāo),以 A420 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 β半乳糖苷酶酶活力測(cè)定 mol/L鄰硝基苯βD半乳吡喃糖苷(ONPG)的0.05 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為6.5)混勻,37 ℃反應(yīng)10 min后, mol/L的Na2CO3終止液靜置5 min,于420 nm比色測(cè)定生成鄰硝基苯酚(ONP)濃度。1個(gè)酶活性單位(u)定義為在37℃下每分鐘分解出1μmol ONP所需的酶量。 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 菌種生長(zhǎng)曲線測(cè)定在篩選平板上挑一單菌落接種于裝液量30 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,37℃、225r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng),分別于0、1123460h取樣。每個(gè)處理重復(fù)3次。以未接種的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為空白對(duì)照。測(cè)定菌液的吸光度OD595 (即生物量)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo);OD595為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)物線。 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響將種子菌液以2%的比例接種到裝有30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中.在37℃、225 r/min的條件下培養(yǎng),分別于0、1123460 h取樣,每個(gè)處理重復(fù)3次,測(cè)定生物量和酶活性并繪制曲線。 接種量對(duì)菌株BGJ222產(chǎn)酶能力的影響 、、、%的比例接種到裝有30 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中,于37 ℃、225 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h取樣測(cè)定β半乳糖苷酶表達(dá)量,每個(gè)處理重復(fù)3次。 pH值對(duì)β半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響,確定pH值對(duì)β半乳糖苷酶活力的影響。緩沖液分別為醋酸鈉(,)、磷酸鈉(,)和Tris—HCl(,),相對(duì)酶活用百分比來表示。將β半乳糖苷酶在上述緩沖液中37℃保溫2 h和24h后,測(cè)殘留的酶活力,分析pH值對(duì)β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。 溫度對(duì)β半乳糖苷酶活力和穩(wěn)定性的影響測(cè)定β半乳糖苷酶粗酶液在不同溫度(溫度范圍為2575℃)時(shí)的酶活力,確定溫度對(duì)β半乳糖苷酶活力的影響。 mol/L磷酸鈉緩沖液()混勻后,分別在30,40,50,和60℃保溫4 h,每隔1 h測(cè)一次殘留的酶活,分析溫度對(duì)β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。 不同金屬離子及離子濃度對(duì)β半乳糖苷酶的影響 mol/L磷酸鈉緩沖液()混勻,并添加各種不同的金屬離子(K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Fe2+、Ca2+、Zn2+和Fe3+),于37℃測(cè)定酶活。東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文第3章 β半乳糖苷酶酶學(xué)性質(zhì) 高產(chǎn)β半乳糖苷酶細(xì)菌的篩選用土壤為樣本,以乳糖為唯一碳源,篩選出乳糖利用菌株。菌種純化后測(cè)定其β半乳糖苷酶水解活性,得到酶活較高的菌株8株。表1 列出了篩選獲得的9株菌的β半乳糖苷酶水解活性的測(cè)定結(jié)果。表31 10株β半乳糖苷酶水解活性菌株編號(hào)特征描述OD420酶活(U/mL) 1乳白偏黃,半透明,邊緣圓滑不規(guī)則,菌落中等大小2乳白色,幾乎不透明,邊緣圓滑,菌落很小3乳白色,半透明,邊緣圓滑,菌落中等大小4乳白色,半透明,邊緣圓滑,菌落很小5微紅,半透明,邊緣圓滑,菌落中等偏小6乳白色,半透明,邊緣圓滑,菌落較大7玫瑰紅色,不透明,邊緣分枝狀,菌落中等偏小8淡黃色,半透明,邊緣圓滑,菌落中等偏小從上表中可看出,1號(hào)菌株的酶活性最高,所以選擇1號(hào)菌株作為實(shí)驗(yàn)用菌株。根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn),初步判斷其為枯草芽孢桿菌。 鄰硝基苯酚(ONP)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖32 鄰硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=+,R2= 菌株生長(zhǎng)曲線測(cè)定由圖33可見,單菌落生長(zhǎng)經(jīng)過6 h的遲緩期后,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,12 h后達(dá)到穩(wěn)定期,生長(zhǎng)到60 h后由于營(yíng)養(yǎng)的耗盡以及環(huán)境pH變化和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累,細(xì)菌生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌代謝旺盛、酶活性高而且穩(wěn)定,菌體大小比較一致。菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為培養(yǎng)的第l0小時(shí)左右。因此,以下試驗(yàn)均采用單菌落培養(yǎng)10 h的菌液作為種子菌液。圖33 菌株生長(zhǎng)曲線 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響由圖34可見,菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中經(jīng)過2 h的延緩期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,經(jīng)過4 h的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后,進(jìn)入平緩期。β半乳糖苷酶在菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期表達(dá)量很低,進(jìn)入平緩期后β半乳糖苷酶開始大量表達(dá)。培養(yǎng)24 h時(shí)β半乳糖苷酶的表達(dá)量達(dá)到高峰,為860,之后逐漸下降,整個(gè)過程呈現(xiàn)出典型的“S”型。所以,在以下試驗(yàn),培養(yǎng)時(shí)間均設(shè)定為24 h時(shí)取樣。圖34 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶能力影響 接種量對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的影響由圖35可見,隨著接種量的增加,β半乳糖苷酶表達(dá)量逐漸增加,%時(shí)達(dá)到最高.以后又隨著接種量的增加β半乳糖苷酶表達(dá)量逐漸降低。接種量太小,菌的生物量不足,對(duì)產(chǎn)酶不利,接種量太大,營(yíng)養(yǎng)不足,同樣會(huì)影響酶的表達(dá)量。%效果最佳。圖35 接種量對(duì)產(chǎn)酶能力的影響 pH對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響pH值對(duì)酶催化反應(yīng)的影響分別為影響酶催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物效率以及酶的穩(wěn)定性。~,結(jié)果如圖331所示。由圖332可以看出。β半乳糖苷酶37℃保溫24 h后仍有80%的活力。圖361 pH對(duì)酶活性的影響圖362 pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響 溫度對(duì)酶活性和穩(wěn)定性的影響從圖371可以看出,酶的最適溫度在35℃左右,40℃時(shí)仍能保持90%以上活力,40℃之后酶活開始下降,60℃時(shí)只剩30%左右。由圖372可以看出,在30 ℃和40℃時(shí),保溫處理4 h后仍有85%酶活力。圖371 溫度對(duì)酶活的影響圖372 溫度對(duì)酶的穩(wěn)定性的影響同金屬離子及離子濃度對(duì)β半乳糖苷酶的影響結(jié)果如表38所示。由表38可以看出.在各種金屬離子中,K+、Na+、Mn2+和Mn2+在適當(dāng)濃度范圍內(nèi)對(duì)β半乳糖苷酶酶活有促進(jìn)作用,但隨著濃度增加,促進(jìn)作用減弱或變成抑制,其中Mg2+對(duì)β半乳糖苷酶活力的促進(jìn)效果最明顯,當(dāng)添加濃度為10 mmol/L的Mg2+時(shí),%。Fe2+、Fe3+、Ca2+、Zn2+和Cu2+對(duì)β乳糖苷酶酶活有抑制作用,且隨濃度增加抑制作用加強(qiáng),其中Cu2+的抑制作用最強(qiáng)。在反應(yīng)液中加入濃度為1mmol/L Cu2+后,β半乳糖苷酶即失去活力。表38 金屬離子對(duì)酶活性影響試劑相對(duì)酶活100%1mmol/L10mmol/L100mmol/L空白對(duì)照Fe3+ndFe2+K+Na+Mn2+Mn2+Ca2+ndZn2+ndndCu2+ndndnd注:nd表示酶的相對(duì)活性低于5%,可忽略不計(jì)。第4章 酶的固定化研究酶是由生物體產(chǎn)生的具有催化活性的蛋白質(zhì),它能特定地促成某個(gè)化學(xué)反應(yīng)而本身卻不參加反應(yīng),具有催化效率高,條件溫和,反應(yīng)產(chǎn)物污染小,能耗低,反應(yīng)容易控制等特點(diǎn)。這是任何無機(jī)催化劑都無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。但因?yàn)槊傅幕瘜W(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),其最大弱點(diǎn)是不穩(wěn)定性,對(duì)酸、堿、熱及有機(jī)溶液容易發(fā)生酶蛋白的變性作用,從而降低或失去活性。而且酶往往在溶液中進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)以后會(huì)殘留在溶液系統(tǒng)中不易回收,造成最終產(chǎn)品生化分離提純操作上的麻煩。加之酶反應(yīng)只能分批進(jìn)行,難于連續(xù)化、自動(dòng)化操作。這大大地阻礙了酶工程的發(fā)展應(yīng)用。為克服上述缺點(diǎn),要將游離酶固定化后進(jìn)行應(yīng)用。固定化酶技術(shù)是把從生物體內(nèi)提取出來的酶,用人工方法固定在特定的載體上。由于固定化酶的運(yùn)動(dòng)被化學(xué)或物理的方法限制了,能將其從反應(yīng)介質(zhì)中回收,所以它原則上能在批量操作或連續(xù)操作中重復(fù)使用。固定化酶是用物理的或化學(xué)的方法使酶與水不溶性大分子載體結(jié)合或把酶包埋在水不溶性凝膠或半透膜的微囊體中制成的。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加,易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離,且易于控制,能反復(fù)多次使用。便于運(yùn)輸和貯存,有利于自動(dòng)化生產(chǎn)。固定化酶是近十余年發(fā)展起來的酶應(yīng)用技術(shù),在工業(yè)生產(chǎn)、化學(xué)分析和醫(yī)藥等方面有誘人的應(yīng)用前景[14]。固定化酶的研究始于 1910 年,正式研究于 20 世紀(jì) 60 年代,70 年代已在全世界普遍開展。酶的固定化 (Immobilization ofenzymes)是用固體材料將酶束縛或限制于一定區(qū)域內(nèi),仍能進(jìn)行其特有的催化反應(yīng)、并可回收及重復(fù)利用的一類技術(shù)。與游離酶相比,固定化酶在保持其高效專一及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí),
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