【正文】 植于腸道內(nèi)，它們?nèi)阅艽x被攝入人體內(nèi)的乳糖。因此，乳酸菌可以廣泛用于各種乳品加工生產(chǎn)低乳糖制品。采用篩選出的菌種進(jìn)行酸奶加工，驗(yàn)證其加工性能，掌握其工藝加工性能和應(yīng)用于乳品加工的潛力，從而將其應(yīng)用于乳品發(fā)酵產(chǎn)品，降低乳糖含量，緩解人體普遍存在的乳糖不耐癥，擴(kuò)大乳品的消費(fèi)量。具有較高β半乳糖苷酶活性的乳酸菌能將牛奶中的乳糖分解為葡萄糖和半乳糖，這對(duì)于乳品行業(yè)的發(fā)展具有很大的應(yīng)用潛力。此外，β半乳糖苷酶可被加工成液態(tài)、藥劑或粉末狀形式的產(chǎn)品，用來(lái)治療乳糖不耐癥。這些都為產(chǎn)β半乳糖苷酶的開(kāi)發(fā)利用提供了潛在的發(fā)展市場(chǎng)。 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)歷史上，β半乳糖苷酶的研究為微生物學(xué)的發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。國(guó)外對(duì)β半乳糖苷酶的研究較早，許多研究工作主要集中在β半乳糖苷酶在食品加工中的應(yīng)用。1889年，荷蘭生物學(xué)家Beijerincek第一次報(bào)道了β半乳糖苷酶可水解乳糖。1944年Whitter[1]就比較全面的討論了β半乳糖苷酶的應(yīng)用。1948年Caputto[2]等討論了通過(guò)大量培養(yǎng)和純化脆壁酵母（Saccharimyces fragilis）生產(chǎn)β半乳糖苷酶的方法。法國(guó)的雅各（Jacob）和莫諾德（Monod）[3]通過(guò)對(duì)大腸桿菌β半乳糖苷酶的研究，于1961年提出了乳糖操縱子學(xué)說(shuō)，闡明了酶生物合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，使酶的生物合成可以按人們的意志加以調(diào)控，為研究其他生物的代謝調(diào)控提供了依據(jù)。1972年Rorglun等報(bào)道了真菌β半乳糖苷酶的特性。進(jìn)入80年代，Jrodon等[4]首次對(duì)小鼠成功的獲得了動(dòng)物基因轉(zhuǎn)移，是純合子動(dòng)物分泌的乳汁中完全不含乳糖，為利用基因工程生產(chǎn)低乳糖牛乳奠定了基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)對(duì)β半乳糖苷酶的研究起步較晚，是在20世紀(jì)80年代以后開(kāi)始的。1980年天津工業(yè)微生物研究所[5]組成β半乳糖苷酶研究組，對(duì)β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌的選育、發(fā)酵工藝研究、酶的提取純化、酶學(xué)特性的進(jìn)行了較為全面的研究。1990年無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)的李強(qiáng)軍等選育到黑曲霉菌CWL2NU3，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后產(chǎn)酶活力達(dá)12u/ml（ONPG單位）。1985年?yáng)|北農(nóng)業(yè)大學(xué)的萬(wàn)賢生對(duì)β半乳糖苷酶在乳清中的綜合利用展開(kāi)了研究。上海復(fù)旦大學(xué)的郭杰炎等以乳酸酵母Y121發(fā)酵生產(chǎn)的β半乳糖苷酶活力達(dá)40u/ml（ONPG單位），干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活殘存98%。目前，β半乳糖苷酶主要用于低乳糖制品的研制和開(kāi)發(fā)，以滿(mǎn)足乳糖不耐癥患者對(duì)乳制品消費(fèi)的需求。工業(yè)生產(chǎn)上最直接、有效的方法就是將酶直接加入到牛乳中制得乳糖水解乳，該法水解條件溫和（~8，溫度50~60℃），產(chǎn)物簡(jiǎn)單，不會(huì)破壞乳中的其他營(yíng)養(yǎng)成分。國(guó)外已有一些大公司生產(chǎn)商業(yè)用乳糖酶制劑，用于生產(chǎn)乳糖水解乳制品。隨著研究的不斷深入，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的β半乳糖苷酶活性會(huì)進(jìn)一步得到提高。如果在國(guó)內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)β半乳糖苷酶的工業(yè)化生產(chǎn)，其制品的生產(chǎn)和應(yīng)用成本將會(huì)大幅度降低。因此，β半乳糖苷酶具有廣闊的市場(chǎng)前景，并且會(huì)取得相當(dāng)可觀的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。 β半乳糖苷酶的來(lái)源及其特性β半乳糖苷酶存在于植物（尤其是杏、桃、蘋(píng)果），細(xì)菌（大腸桿菌、乳酸菌等），真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母等），放線(xiàn)菌以及哺乳動(dòng)物（特別是嬰兒）的腸道中。目前僅來(lái)源于微生物的β半乳糖苷酶有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，利用微生物發(fā)酵法制取β半乳糖苷酶，酶源豐富，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，周期短，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響。不同微生物來(lái)源的β半乳糖苷酶的性質(zhì)有所不同[6]。 細(xì)菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶細(xì)菌β半乳糖苷酶，尤其是嗜熱細(xì)菌產(chǎn)生的酶正得到廣泛的研究，到目前為止，大腸桿菌（Escherichia coli）產(chǎn)生的β半乳糖苷酶是研究的最徹底、最深入，并已大量用于生化分析中。細(xì)菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶是胞內(nèi)酶，在培養(yǎng)過(guò)程中不能分泌到培養(yǎng)基中，它的耐熱性較高，這一點(diǎn)有利于固定化酶的制造。但因產(chǎn)量低及可能的毒性問(wèn)題，故迄今未用于工業(yè)化生產(chǎn)。 酵母菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶酵母菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶通常是胞內(nèi)酶，制備純品必須破碎細(xì)胞，該酶對(duì)酸、熱較不穩(wěn)定，當(dāng)某些離子存在時(shí)，才有最大活性，因此不適于在工業(yè)上進(jìn)行應(yīng)用。但是，酵母菌容易培養(yǎng)，在深層培養(yǎng)條件下可以大量生產(chǎn)β半乳糖苷酶，這些優(yōu)點(diǎn)掩蓋了它的不足，故酵母菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶才得以成功的進(jìn)行開(kāi)發(fā)。酵母菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶最適pH近于中性，與牛乳的天然pH值接近，最適溫度較低，適于處理牛乳和甜乳清中的乳糖。脆壁酵母和乳酸酵母（Saccharimyces lactic）是生產(chǎn)β半乳糖苷酶的主要酵母菌種。 霉菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶霉菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶是胞外酶，可以用固態(tài)培養(yǎng)也可以采用液態(tài)深層培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)，在培養(yǎng)過(guò)程中酶分泌到培養(yǎng)基中，提取較為方便。霉菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶較耐熱、耐酸，不需要活化劑和穩(wěn)定劑，穩(wěn)定性較高。，米曲霉產(chǎn)生的β半乳糖苷酶即使在45℃高溫下貯藏6個(gè)月，%。曲霉β半乳糖苷酶的最適pH值較低，適用于面包的制造以及分解面團(tuán)中的乳糖，有利于酵母發(fā)酵，并使制品具有良好的色澤。同時(shí)，由于它較為穩(wěn)定，有很好的耐受性，比酵母β半乳糖苷酶更適合于固定化酶的制造。目前應(yīng)用較多的霉菌β半乳糖苷酶產(chǎn)生菌主要是米曲霉（Aspergillus oryzse）和黑曲霉（Aspergillus niger）。 β半乳糖苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 解決乳糖不耐癥患者的乳品消費(fèi)問(wèn)題牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物以及幾乎全部已知的維生素，尤其是牛乳中含有豐富的鈣質(zhì)，且極易被人體吸收，被譽(yù)為“近乎完善的食物”。但據(jù)有關(guān)資料報(bào)道，有10％的白人，51％的印第安人，81％的非裔加勒人和70％的亞洲人由于腸道內(nèi)缺乏β半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不適癥(又稱(chēng)乳糖不耐癥)[7]。用β半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖以滿(mǎn)足乳糖不適癥患者的需要，是較為實(shí)用、有效的方法。采用給患者同時(shí)服用乳制品和β半乳糖苷酶片(通常是霉菌β半乳糖苷酶，它的最適pH值與胃環(huán)境相一致)，也可以解決這一問(wèn)題。 提高乳制品的甜度乳糖的甜度較低，只有蔗糖的20％，水解后，一分子乳糖生成一分子葡萄糖和一分子半乳糖，可以明顯提高乳制品的甜度，減少甜味劑的用量，而且不增加食品的熱量[8]。 防止乳制品冷凍時(shí)出現(xiàn)結(jié)晶乳糖的溶解度較低，只有蔗糖的10％，在制作冷凍乳制品時(shí)容易結(jié)晶析出，影響產(chǎn)品質(zhì)量。若在加工中添加25~30％的乳糖水解乳，可防止這類(lèi)質(zhì)量問(wèn)題的出現(xiàn)[9]。 在酸乳制作中的應(yīng)用用β半乳糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脫脂乳省時(shí)且節(jié)省蔗糖用量，而且能改善酸乳風(fēng)味和口感，延長(zhǎng)酸乳的貨價(jià)期。 在乳清加工中的應(yīng)用乳清中含有乳清蛋白、乳糖、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，其中乳清蛋白是完全蛋白質(zhì)。世界年產(chǎn)量約為9180。107T，其中50％當(dāng)廢水排放，不僅造成浪費(fèi)，而且污染環(huán)境。用β半乳糖苷酶將乳清中的乳糖水解，可以提高含乳清飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)去除了乳清濃縮時(shí)乳糖結(jié)晶析出給飼料加工帶來(lái)的不便。此外，用此水解物還可生產(chǎn)乳清飲料、糖漿、食品添加劑等[10]。 在乳味面包中的應(yīng)用在乳味面包制作中，添加β半乳糖苷酶水解乳，能夠增加面包甜度，提高酵母菌產(chǎn)氣量，使面包更加膨脹，而且水解乳中的半乳糖有利于褐變，改善面包色澤。 生產(chǎn)低聚半乳糖(Galactooligosaccharide)低聚半乳糖是以牛乳或乳清中的乳糖為底物，經(jīng)β半乳糖苷酶催化作用而得到的。低聚半乳糖的熱穩(wěn)定性較好，即使在酸性條件下也是如此，并且具有許多生理功能，如作為雙歧桿菌增殖因子；能促進(jìn)鈣質(zhì)吸收和防止骨質(zhì)減少；有利于促進(jìn)有機(jī)酸生成，降低腸道pH值，抑制外源菌的生長(zhǎng)代謝；有利于B族維生素產(chǎn)生；低能量；低致齲齒性；改善脂質(zhì)代謝等[11]。 分析食品中乳糖含量將精制的β半乳糖苷酶和其它酶(如過(guò)氧化物酶、葡萄糖氧化酶)聯(lián)合使用可以分析冰淇淋、干酪和含牛乳的干制品中的乳糖含量。該法簡(jiǎn)便快捷，費(fèi)用低廉，又可以在樣品不除去蛋白的情況下使用，適合于在食品工業(yè)上進(jìn)行應(yīng)用[12]。 β半乳糖苷酶在制藥工業(yè)中的應(yīng)用β半乳糖苷酶是酶類(lèi)藥物，適用于嬰兒各種消化不良癥，如先天性乳糖酶缺乏癥、由胃障礙及缺鐵所致的幼兒慢性腹瀉、幼兒及新生兒腹瀉，由感冒及消化不良等引起的繼發(fā)性腹瀉。加入牛乳中則可防止由牛乳中乳糖不能吸收而引起的乳糖不耐癥。 β半乳糖苷酶在酶聯(lián)免疫反應(yīng)(EIA)中的應(yīng)用β半乳糖苷酶經(jīng)戊二醛一步標(biāo)記抗人IgG，建立了ELISA測(cè)定程序，已用于人IgG、人群破傷風(fēng)抗體、單克隆抗體檢測(cè)，獲得滿(mǎn)意結(jié)果。同時(shí)用于孕酮、皮質(zhì)醇半抗原標(biāo)記，初步建立了該酶的液相競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定程序。近年來(lái)，又報(bào)道了合成該酶的大分子底物，因此，β半乳糖苷酶不僅可用作超微量熒光酶聯(lián)分析，而且還可以在酶放大免疫測(cè)定（EMIT）和底物標(biāo)記熒光分析中進(jìn)行應(yīng)用（SLFIA）[13]。31東北電力大學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文第2章 材料和方法 材料 材料與試劑菌種來(lái)源：春光乳制品廠附近采集的土壤鄰硝基苯βD半乳吡喃糖苷（ONPG）分析純鄰硝基苯酚（ONP）分析純5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷（Xgal）分析純二甲基甲酰胺（DMF）分析純蛋白胨、乳糖、瓊脂、酵母粉、NaCl 均為分析純 儀器與設(shè)備752型紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京光學(xué)儀器廠HQZF全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司LRH250II生化培養(yǎng)箱 廣州醫(yī)療設(shè)備廠PB10 pH計(jì) Sartorius0．20 u m無(wú)菌濾器 SartoriuszC10恒溫水浴槽 寧波天恒儀器廠 培養(yǎng)基分離選擇培養(yǎng)基：蛋白胨2%，瓊脂2%，Xgal 20mg/ml，%，乳糖2%，%，蒸餾水100ml，~,121℃高壓蒸汽滅菌15~30min。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2%，%，乳糖2%，%，蒸餾水200ml，pH自然。 產(chǎn)β半乳糖苷酶菌的篩選