【正文】 半乳糖苷酶經(jīng)戊二醛一步標記抗人IgG，建立了ELISA測定程序，已用于人IgG、人群破傷風抗體、單克隆抗體檢測，獲得滿意結果。 分析食品中乳糖含量將精制的β半乳糖苷酶和其它酶(如過氧化物酶、葡萄糖氧化酶)聯(lián)合使用可以分析冰淇淋、干酪和含牛乳的干制品中的乳糖含量。此外，用此水解物還可生產(chǎn)乳清飲料、糖漿、食品添加劑等[10]。 在乳清加工中的應用乳清中含有乳清蛋白、乳糖、礦物質和維生素等營養(yǎng)成分，其中乳清蛋白是完全蛋白質。 提高乳制品的甜度乳糖的甜度較低，只有蔗糖的20％，水解后，一分子乳糖生成一分子葡萄糖和一分子半乳糖，可以明顯提高乳制品的甜度，減少甜味劑的用量，而且不增加食品的熱量[8]。 β半乳糖苷酶在食品工業(yè)中的應用 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 解決乳糖不耐癥患者的乳品消費問題牛乳中含有豐富的蛋白質、脂肪、碳水化合物以及幾乎全部已知的維生素，尤其是牛乳中含有豐富的鈣質，且極易被人體吸收，被譽為“近乎完善的食物”。米曲霉產(chǎn)生的β半乳糖苷酶即使在45℃高溫下貯藏6個月，%。酵母菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶最適pH近于中性，與牛乳的天然pH值接近，最適溫度較低，適于處理牛乳和甜乳清中的乳糖。細菌產(chǎn)生的β半乳糖苷酶是胞內(nèi)酶，在培養(yǎng)過程中不能分泌到培養(yǎng)基中，它的耐熱性較高，這一點有利于固定化酶的制造。 β半乳糖苷酶的來源及其特性β半乳糖苷酶存在于植物（尤其是杏、桃、蘋果），細菌（大腸桿菌、乳酸菌等），真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、熱帶假絲酵母等），放線菌以及哺乳動物（特別是嬰兒）的腸道中。國外已有一些大公司生產(chǎn)商業(yè)用乳糖酶制劑，用于生產(chǎn)乳糖水解乳制品。1985年東北農(nóng)業(yè)大學的萬賢生對β半乳糖苷酶在乳清中的綜合利用展開了研究。進入80年代，Jrodon等[4]首次對小鼠成功的獲得了動物基因轉移，是純合子動物分泌的乳汁中完全不含乳糖，為利用基因工程生產(chǎn)低乳糖牛乳奠定了基礎。1944年Whitter[1]就比較全面的討論了β半乳糖苷酶的應用。這些都為產(chǎn)β半乳糖苷酶的開發(fā)利用提供了潛在的發(fā)展市場。因此，乳酸菌可以廣泛用于各種乳品加工生產(chǎn)低乳糖制品。常見的去除乳糖的方法有大豆配方和水解配方，因此開發(fā)可以分解乳糖的酶或微生物以水解配方解決乳糖不耐癥的方法成為研究的主要方向。但是由于乳糖不耐癥的存在，很多人難以食用牛奶或其他乳制品，這極大地抑制了乳品行業(yè)的發(fā)展。乳糖酶缺乏癥人群的乳糖攝入量超過其胃腸消化能力時，就會導致乳糖代謝不完全。其結構基因為LacZ(半乳糖苷酶)，與LacY（半乳糖苷透性酶）和LacA（半乳糖苷轉乙酰酶）共同組成乳糖操縱子，并在特異的乳糖操縱系統(tǒng)中的阻遏物、操縱基因、啟動子等的協(xié)同下，支配調節(jié)β半乳糖苷酶的合成。 11 不同金屬離子及離子濃度對β半乳糖苷酶的影響。但固定化酶珠體機械強度較差，尚待改進。以海藻酸鈉為栽體、戊二醛為交聯(lián)劑，對乳糖酶進行固定化。摘 要摘 要從土壤中篩選出一株產(chǎn)β半乳糖苷酶的枯草芽孢桿菌，并對菌株和其產(chǎn)生的β半乳糖苷酶進行了測定。研究了海藻酸鈉濃度、氯化鈣濃度、戊二醛濃度、固定化時間對酶固定化的影響，并對固定化酶酶促反應的最適pH、溫度等進行了測定。關鍵詞：β半乳糖苷酶 酶活性 酶的固定化IAbsractAbsractA strain isolated from soil in producing βgalactosidase of Bacillus subtilis, and strains and βgalactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was %, the best culture time 24h。 11第3章β半乳糖苷酶酶學性質 12 高產(chǎn)β半乳糖苷酶細菌的篩選 12 鄰硝基苯酚（ONP）標準曲線 12 菌株生長曲線測定 13 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶能力的影響 14 接種量對菌株產(chǎn)酶能力的影響 14III pH對酶活性和穩(wěn)定性的影響 15 溫度對酶活性和穩(wěn)定性的影響 16 17第4章 酶的固定化研究 19 19 酶的固定方法 20 包埋法 20 吸附法 20 吸附法 20 20 固定化酶反應器的類型 21(Continuous Flow Stirred Tand Reactor，CSTR) 21(Packed Bed Reactor，PBR) 22(Fluidzed Bed Reactor，F(xiàn)BR) 23(Hollow Fiber Reactor) 23 固定化乳糖酶國內(nèi)外研究進展 24 國外研究進展 24 國內(nèi)研究進展 25 β半乳糖苷酶的固定 26 包埋材料選擇 26 β半乳糖苷酶固定方法 26 固定酶活力測定 26 固定化的最適條件 27 海藻酸鈉濃度的確定 27 CaCl2濃度的確定 27 固定化時間的確定 28 28 固定化酶的酶學性質 29 固定化酶的最適pH 29 30 固定化酶的催化反應機理探討 30 固定化酶對反應體系的影響 31 影響固定化酶的動力學因素 31 固定化酶保護劑的篩選 32參 考 文 獻 34致 謝 35III 第1章 緒 論第1章 緒 論 研究背景β半乳糖苷酶（βgalactosidase），全名為βD半乳糖苷水解酶（βDgalactoside galcagalcatohydrolase，），常簡稱為乳糖酶。當培養(yǎng)基中無誘導物質時，每一細胞中雖然沒有幾個分子的β半乳糖苷酶，但一旦被誘導，則每一世代都能合成多達幾千個分子的酶。未被消化的乳糖在滲透壓的作用下進入腸內(nèi)被其他細菌分解代謝，會生成乳酸以及其他有機酸，導致消化不良和胃腸不適。乳糖消化的程度取決于以下幾種因素：乳糖攝入量、在腸胃內(nèi)停留時間（由飲食時間決定）、β半乳糖苷酶攝入量以及乳制品攝入量。 課題研究目的和意義β半乳糖苷酶可以有效降低乳制品中乳糖含量。采用篩選出的菌種進行酸奶加工，驗證其加工性能，掌握其工藝加工性能和應用于乳品加工的潛力，從而將其應用于乳品發(fā)酵產(chǎn)品，降低乳糖含量，緩解人體普遍存在的乳糖不耐癥，擴大乳品的消費量。 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢歷史上，β半乳糖苷酶的研究為微生物學的發(fā)展作出了巨大貢獻。1948年Caputto[2]等討論了通過大量培養(yǎng)和純化脆壁酵母（Saccharimyces fragilis）生產(chǎn)β半乳糖苷酶的方法。國內(nèi)對β半乳糖苷酶的研究起步較晚，是在20世紀80年代以后開始的。上海復旦大學的郭杰炎等以乳酸酵母Y121發(fā)酵生產(chǎn)的β半乳糖苷酶活力達40u/ml（ONPG單位），干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活殘存98%。隨著研究的不斷深入，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的β半乳糖苷酶活性會進一步得到提高。目前僅來源于微生物的β半乳糖苷酶有工業(yè)應用價值，利用微生物發(fā)酵法制取β半乳糖苷酶，酶源豐富，產(chǎn)量高，生產(chǎn)成本低，周期短，而且不受季節(jié)、地理位置等因素的影響。但因產(chǎn)量低及可能的毒性問題，故迄今未用于工業(yè)化生產(chǎn)。脆壁酵母和乳酸酵母（Saccharimyces lactic）是生產(chǎn)β半乳糖苷酶的主要酵母菌種。曲霉β半乳糖苷酶的最適pH值較低，適用于面包的制造以及分解面團中的乳糖，有利于酵母發(fā)酵，并使制品具有良好的色澤。但據(jù)有關資料報道，有10％的白人，51％的印第安人，81％的非裔加勒人和70％的亞洲人由于腸道內(nèi)缺乏β半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不適癥(又稱乳糖不耐癥)[7]。 防止乳制品冷凍時出現(xiàn)結晶乳糖的溶解度較低，只有蔗糖的10％，在制作冷凍乳制品時容易結晶析出，影響產(chǎn)品質量。世界年產(chǎn)量約為9180。 在乳味面包中的應用在乳味面包制作中，添加β半乳糖苷酶水解乳，能夠增加面包甜度，提高酵母菌產(chǎn)氣量，使面包更加膨脹，而且水解乳中的半乳糖有利于褐變，改善面包色澤。該法簡便快捷，費用低廉，又可以在樣品不除去蛋白的情況下使用，適合于在食品工業(yè)上進行應用[12]。同時用于孕酮、皮質醇半抗原標記，初步建立了該酶的液相競爭測定程序。 產(chǎn)β半乳糖苷酶菌的篩選 菌株篩選方法 取土樣，稀釋10倍，置于80℃水浴鍋中加熱30min，以去除不產(chǎn)芽孢的菌體。 β半乳糖苷酶粗酶液制備將純化菌株按體積分數(shù)為1％的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h。取 7 支試管分別吸取 0， ， ， ， ， ， ， ， 5mmol/ml ONP，補上述緩沖液至 ，然后 40℃保溫15min，加入 2mL ，1mol/LNaCO3，以第一管為空白，于 420nm 測定吸光度，以 ONP 的量為橫坐標，以 A420 為縱坐標繪制標準曲線。每個處理重復3次。 培養(yǎng)時間對菌株產(chǎn)酶能力的影響將種子菌液以2％的比例接種到裝有30 mL基礎培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中．在37℃、225 r/min的條件下培養(yǎng)，分別于0、1123460 h取樣，每個處理重復3次，測定生物量和酶活性并繪制曲線。將β半乳糖苷酶在上述緩沖液中37℃保溫2 h和24h后，測殘留的酶活力，分析pH值對β半乳糖苷酶穩(wěn)定性的影響。東北電力大學學士畢業(yè)論文第3章 β半乳糖苷酶酶學性質 高產(chǎn)β半乳糖苷酶細菌的篩選用土壤為樣本，以乳糖為唯一碳源，篩選出乳糖利用菌株。根據(jù)菌種的生理生化特點，初步判斷其為枯草芽孢桿菌。因此，以下試驗均采用單菌落培養(yǎng)10 h的菌液作為種子菌液。所以，在以下試驗，培養(yǎng)時間均設定為24 h時取樣。圖35 接種量對產(chǎn)酶能力的影響 pH對酶活性和穩(wěn)定性的影響pH值對酶催化反應的影響分別為影響