【文章內容簡介】 濾色譜復性凝膠過濾復性時，變性蛋白質加樣于折疊緩沖液平衡好的凝膠過濾柱上，然后用折疊緩沖液進行洗脫，凝膠過濾層析有不同的分子量分級范圍，有助于聚集蛋白質和正確折疊蛋白質的分離。血小板衍生的生長因子（PDGF）由兩個亞基組成，M252。ller等用雙順反子表達載體同時表達等摩爾的A鏈和B鏈，但以包涵體的形式存在，為了得到活性的異源二聚體PDGFAB，包涵體用鹽酸胍變性后，先在變性條件下用凝膠過濾層析進行純化，使用稀釋復性，蛋白質嚴重聚集，即使在10μg/ml蛋白質濃度條件下，也只能得到45%可溶性蛋白，而用凝膠過濾復性，同時洗脫的A亞基和B亞基可以緩慢二聚化產生異源二聚體，,最終異源二聚體得率可達75%（26）。在凝膠過濾復性中，發(fā)展了一種梯度復性的方法，這一方法的原理基于復性過程中，變性條件的快速改變加速了部分折疊蛋白質的聚集，導致沉淀形成和非特異性的吸附，通過梯度洗脫逐步降低變性劑的濃度，使蛋白質處于一個梯度改變的變性劑條件下，控制蛋白質的折疊和聚集速度，使蛋白質在離開層析柱時，處于折疊緩沖液中，從而改善活性蛋白的回收率。通常選擇線性的梯度用于折疊復性，對于不同的蛋白質還有其它的模式，如一些蛋白在特定的變性劑濃度范圍里不穩(wěn)定，在此變性劑濃度范圍里就需要快速降低變性劑濃度。這一復性過程中，梯度在上樣前就在層析柱中已經形成，上樣后使用變性緩沖液進行洗脫，由于蛋白質受到的分子排阻比變性劑大，蛋白質移動的速度比變性劑梯度移動的速度快，最終蛋白質通過整個變性劑區(qū)，離開層析柱時處于折疊緩沖液中。通過尿素線性梯度復性，變性溶菌酶以高蛋白濃度上樣（17mg/ml）可以獲得90%的活性回收率，與稀釋復性和非梯度凝膠過濾復性相比較，顯著的改善了活性回收率（27）。對單鏈Fv片段包涵體蛋白，使用梯度同時改變變性劑濃度和pH，比單改變變性劑濃度的梯度復性或不使用梯度的凝膠過濾復性具有更高的活性得率（28）。另外應用連續(xù)環(huán)形色譜，蛋白樣品連續(xù)上樣于旋轉的色譜柱上，在提高折疊效率的同時，也提高了色譜復性處理的能力（29,30）。B. 吸附型色譜復性吸附型色譜復性是在變性條件下，利用變性蛋白質可瞬間結合在特定層析介質上的特性，進行緩沖液的交換，降低變性劑的濃度，可先改變變性劑濃度使吸附的蛋白質逐漸的折疊復性，在柱中的變性劑溶液完全被置換成折疊緩沖液后，再通過在折疊緩沖液中加入鹽或其它添加劑進行原位純化洗脫，為了獲得好的折疊效率和純化效率，常采用梯度洗脫或階段洗脫的方法。由于蛋白質結合在固相介質上，減少了折疊過程中由于分子間相互作用所造成的聚集，所以這一方法可提高折疊的效率。在變性條件下，蛋白質能否進行離子交換色譜復性和疏水色譜復性，與蛋白質的理化性質密切相關，僅有有限的報道（36），而給蛋白質加上一個親和標簽，表達得到的包涵體再用親和色譜復性對不同的蛋白質有一定的通用性，應用也更為廣泛，尤其是金屬螯合親和色譜復性。多肽通過在N端或C端加上一個親和標簽，在包涵體的純化上有兩個方面的用途，其一是包涵體變性溶解后，利用親和色譜直接進行包涵體溶液的純化，再用稀釋或透析的方法進行復性(55,57,60,64,65,68)，其二就是用于親和色譜復性(61,66,67,69,70)。由于蛋白質或肽類標簽在變性條件大多失去了與親和介質結合的特性，目前這一技術用的最多的是組氨酸標簽。Zahn等在鎳親和層析柱（NiNTA argrose）上通過鹽酸胍/谷胱甘肽梯度進行帶有組氨酸標簽的人朊病毒蛋白多肽片段的氧化再折疊，抑制了蛋白質聚集和分子間二硫鍵的形成，再用咪唑緩沖液對目標蛋白進行洗脫，純化的流程圖如圖4所示(20)。Stempfer等在α葡萄糖苷酶的N端或C端加上多聚精氨酸標簽，研究了變性蛋白在肝素親和介質上的折疊復性，通過優(yōu)化實驗條件，蛋白質可以在5mg/ml濃度條件下高效復性(59)。除了以上的應用，更令人鼓舞的是這一技術已成功用于膜蛋白的復性（24,50,71）。酮戊二酸載體蛋白是線粒體內膜上的一種轉運蛋白， C41（DE3）作為宿主菌使C端帶有組氨酸標簽的目標蛋白形成包涵體獲得大量表達，再用鎳柱親和色譜進行復性和純化，獲得的融合蛋白具有和天然蛋白一樣的轉運活性，每升的細菌培養(yǎng)液可獲得15mg的活性蛋白（50）。C. 由固定化伴侶分子和/或折疊酶介導的色譜復性分子伴侶和折疊酶在蛋白質的正確折疊中起著重要的作用，是近年來的一個研究熱點，它們和蛋白質在體內共表達已經成為促進蛋白質可溶性表達的重要方法。分子伴侶和折疊酶在體外有兩個方面的應用，其一是在溶液中加入伴侶分子和/或折疊酶促進包涵體蛋白質的折疊和裝配（39），另一方面就是通過固定化的伴侶分子和/或折疊酶來介導蛋白質的折疊復性。Altamirano等通過固定化伴侶分子GroEL的活性小片段、脯胺酰異構酶和大腸桿菌氧化還原酶DsbA將蝎子毒素蛋白Cn5的折疊得率從5%提高到87%（18）。在單鏈Fv段的透析復性中，加入固定化的氧化還原酶DsbA和DsbC可以顯著提高折疊的效率，得到的單鏈Fv段和天然Fv段具有相同的功能（46）。 其它的復性方法近年，還有一些其它的方法用于蛋白質的折疊復性，如雙水相萃取復性（76,77,78,79），反向膠束復性（33,75,80），高靜力壓復性（31,81,82,83），這些方法對特定的蛋白質可獲得高的復性效率，大多還停留在研究階段，相信隨著方法的成熟和普及，將會為包涵體蛋白質的折疊復性提供更多的選擇手段。重組蛋白在大腸桿菌中得到表達以后，首先必須從細菌釋放才能進行下游的分離純化過程。蛋白質釋放的方法依賴于蛋白質最終在細胞中的定位。大部分的可溶性重組蛋白在細胞質中表達，而一些膜蛋白常常表達于細胞內膜上，還有一些則分泌到細菌的周質間隙或細胞外。將重組蛋白分泌到周質間隙或細胞外可避免破碎細胞和處理細胞碎片，而且雜蛋白的種類和量都要少得多（在周質空間大約有100種不同蛋白質，而在胞漿內有大約4000種不同的蛋白）。對于分泌到周質間隙的蛋白質，使用滲透壓沖擊，凍融法，溶菌酶處理方法可以使目標蛋白釋放。對于表達于細胞內膜和胞內的蛋白質要經過細胞破碎，常用的方法有高壓勻漿法、超聲破碎法、珠磨法、化學滲透法和酶溶解法，每種方法有自己的特點，現(xiàn)在的研究常常將幾種方法結合，并緊密結合下游固液分離過程（87）。對于表達于細胞膜的蛋白質，先要破碎細胞后分離細胞膜，再抽提溶液進行膜蛋白的提取，由于膜蛋白具有疏水區(qū)域，在抽提溶液中需要加入表面活性劑，一方面破壞細胞膜，溶解膜結構，另一方面促進膜蛋白的溶解和穩(wěn)定，常用Triton X100、 脫氧膽酸鈉、Brij等弱的表面活性劑來保留蛋白質的天然構象。表面活性劑Triton X114的臨界溶液濃度（critical solution temperature）為23℃，在此溫度以下，形成均一的溶液，在此溫度以上，則形成富含表面活性劑的相和低濃度表面活性劑的相，通過溫度誘導的相分離可以使膜蛋白進入富含表面活性劑的相，實現(xiàn)表達膜蛋白的濃縮，是一種應用廣泛的表面活性劑。在膜蛋白的整個分離純化過程中，都要使用表面活性劑來模擬脂質的功能，但膠束與蛋白質的相互作用常常降低層析的分辨率，而且聚集的情況更容易發(fā)生，所以在特定的純化階段選擇哪一種表面活性劑，以及使用多大的濃度，對分離純化的影響最為關鍵（88）。釋放出目標蛋白后，再進行液相和固相細胞碎片的分離，得到澄清的蛋白質溶液就可以進行下游的分離純化了，涉及膜分離技術、沉淀分離技術、萃取技術、層析技術、電泳分離技術，以及一些整合技術，如擴張床吸附，雙水相萃取。膜分離技術和沉淀分離技術是兩種傳統(tǒng)的技術，不管在實驗室研究，還是在工業(yè)的生產上都有應用，近年來功能性膜的應用和膜色譜的發(fā)展大大擴展了膜分離的應用領域，而親和技術和沉淀分離相結合產生了親和沉淀技術，提高了分離的特異性。擴張床吸附和雙水相萃取整合了細胞碎片處理過程和初步濃縮純化過程，在大規(guī)模純化重組蛋白時具有很強的優(yōu)勢。 層析技術在分離純化中的應用層析技術應用于蛋白質的分離純化開始于60年代，現(xiàn)在已成為蛋白質分離純化的高分辨的方法。在層析技術的發(fā)展過程中，首先是基質填料的發(fā)展。由于蛋白質大分子具有高的親水性，要求分離介質具有親水的界面，為活性大分子提供適宜的微環(huán)境，早期的離子交換介質不具有親水的特性和大的孔結構，僅用于小分子的分離純化，Peterson 和 Sober 等在離子交換介質的研究上進行了開拓性的工作，選擇特定的纖維素作為離子交換基團的基質，合成的離子交換纖維素介質具有高的結合容量和低的不可逆性吸附，并得到實際應用（89,90）。在過去的幾十年里各種層析用基質得到發(fā)展，如Sephacryl、Sepharose FF、 Sepharose HP、Superose、Superdex、SOURCE、Mono Beads、Toyopearl，這些基質都有其的物理和化學特點，在蛋白質的分離純化中發(fā)揮著重要的作用。層析技術的另一個發(fā)展方向是功能基團的發(fā)展，適應不同的選擇性要求，如各種不同親和層析介質的合成，使一步純化就能達到很高的純度。層析技術的第三個發(fā)展方向是操作模式的多樣化，已發(fā)展的操作模式有擴張床吸附、模擬移動床層析、置換層析、灌流層析和徑向層析，這幾種方法能夠具有處理大體積樣品的能力，適合于大規(guī)模生產應用。在重組蛋白的分離純化中，各種分離模式都得到應用。凝膠過濾層析是基于液相的分離方法，凝膠包裹的內環(huán)境形成固定相，凝膠的外環(huán)境形成流動相，蛋白質分子越大越不容易滲透進入固定相，所以又稱為分子篩層析，層析的分辨率與介質的排阻極限和上樣的體積有關，是一種易于操作的層析方法，另外凝膠過濾層析常用于緩沖液交換，此時可使用較大的載量。離子交換層析基于蛋白質與離子交換介質電荷間的相互作用，高于蛋白質等電點，蛋白質帶負電荷，低于蛋白質等電點蛋白質帶正電荷，不同的蛋白質在一定的pH條件下與介質上的離子之間相互作用不同，而產生不同的選擇性，根據(jù)帶電基團的類型和強度可分為四種類型：強陰離子交換層析、弱陰離子交換層析、強陽離子交換層析、弱陽離子交換層析，通常采用一定的平衡條件使目標蛋白選擇性的吸附在介質上，也可以使雜蛋白吸附，而目標蛋白選擇性的穿過。疏水層析基于蛋白質表面的疏水區(qū)和介質疏水配體間的相互作用，在高鹽濃度條件下，蛋白質的疏水區(qū)表面上有序排列的水分子通過鹽離子的破壞作用釋放，裸露的疏水區(qū)與疏水配體相互作用而被吸附，隨著鹽濃度的降低，疏水性相互作用也降低，蛋白質的水化層又形成，蛋白質最終解吸附，其它物質，如乙二醇、甘油、非離子表面活性劑也可以降低疏水相互作用，而且疏水相互作用也受pH、溫度和添加劑的影響。疏水層析的選擇性依賴于疏水配體的結構，有烷基配體和芳香基配體，烷基的鏈越長，蛋白質的保留就越強。羥基磷灰石層析常用于的分離純化，對其分離的機制還了解的不清楚，但涉及介質上鈣離子和磷酸根與蛋白上帶電殘基的相互作用。傳統(tǒng)的片狀羥基磷灰石物理和化學穩(wěn)定性比較差，僅能在低流速條件下使用，新的球形羥基磷灰石克服了以上缺點，對于其它方法不易分離的蛋白質，可以用羥基磷灰石層析進行分離純化。等點聚焦層析是基于蛋白質等電點不同的分離模式，以陰離子交換劑為固定相的情況為例，兩性電解質緩沖液和離子交換基團相互作用形成pH梯度，蛋白質在pH 大于其等電點時吸附，在pH低于其等電點時解吸附，由于蛋白質區(qū)帶后部所處微環(huán)境的pH總是低于蛋白質區(qū)帶前部所處微環(huán)境的pH，處于后部區(qū)帶的蛋白質先于前部開始移動，從而產生聚焦效應。親和層析基于蛋白質和親和配體的特異性相互作用，是最為高效的分離純化方法，用于親和層析的配體可以是針對抗原的、針對蛋白質分子的受體、酶的底物或抑制劑、針對糖分子的凝集素、活性染料、金屬離子、天然或改造過的相互作用多肽等等。利用DNA重組技術，進行目標蛋白的融合表達，再用親和層析進行分離純化，已經成為蛋白質表達純化的常用手段。蛋白質能否獲得高效分離純化既與層析介質的理化性質（如配基組成、配基密度、孔徑、表面積、顆粒大小、顆粒分散性）有關，又與流動相參數(shù)（如有機溶劑、pH、金屬離子、解離劑、氧化/還原劑、溫度、緩沖液組成、離子強度、上樣濃度和體積）有關，正是這些理化參數(shù)的變化使得層析技術具有更強的通用性，成為最重要的蛋白質分離純化技術，表3 列出常用層析方法的分離特點和在不同純化階段的應用情況（94）。 親和標簽的在重組蛋白分離純化中的應用在重組蛋白的分離純化中，與其它層析方法相比，親和層析的純化能力更為強大，一步純化就可以得到很高的純度，可以使蛋白質純化1001000倍，活性蛋白的回收率通常很高，而且可以純化其它方法難以分離的蛋白質。從分離的機理上來講，親和層析是一種典型的吸附層析，分子與其介質上的配體結合具有特異性和可逆性，特異性使純化具有選擇性，而可逆性使蛋白質在適宜的條件下洗脫下來?；谥亟M蛋白質與配體的結合特性，一些重組蛋白質應用親和層析進行純化，如將、受體或體外噬菌體展示技術篩選的親和體（affibody）偶聯(lián)在親和介質上進行親和純化，但這類應用僅限于特定的蛋白質，而利用DNA重組技術使目標蛋白與親和標簽融合表達，控制重組分子的親和選擇性，進行融合蛋白的親和純化，已成為純化重組蛋白的常用遺傳策略。除了方便分離純化，親和標簽的融合表達還有以下的優(yōu)點：1. 有的親和標簽可以提高目標蛋白可溶性表達的水平。但要注意的是可溶性表達并不能保證正確的折疊，融合蛋白可以形成可溶性的聚集體（106）。2. 加入的標簽提供檢測目標蛋白的高靈敏度方法，如表位標簽可以使用ELISA和Western blotting 進行定性和定量檢測。3. 親和融合策略已廣泛用于蛋白質蛋白質相互作用研究和蛋白質復合物研究（99）。4. 改善蛋白的藥代和藥動學特性，如一些細胞因子和免疫球蛋白G（IgG）的Fc段融合，可以性顯著增加半衰期，與白蛋白結合結構域結合也可以起到相同的效果。