重組dna技術(shù)與重組蛋白表達(dá)(編輯修改稿)
2025-06-15 22:23 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 動(dòng)子 a2 a1 25℃ 35℃ 兩個(gè)等位基因決定。 a1因子決定 a細(xì)胞特征表達(dá)a2因子阻遏 a細(xì)胞 特征表達(dá)a1a2阻遏 a細(xì)胞特征表達(dá) 編碼 a2因子的基因突變型hmla2102能產(chǎn)生 a2變體 ，它能滅活 a1， 同時(shí)阻遏 a型 酵母啟動(dòng)子的可控性 釀酒酵母 超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 半乳糖誘導(dǎo)效果不明顯，基因基底水平表達(dá) GAL1 GAL7 GAL10 UAS GAL4 GAL80 半乳糖誘導(dǎo)時(shí)， GAL4高效表達(dá)， GAL GAL GAL10超高效表達(dá) GAL10 Promoter 的半乳糖 利用酶系 由 G A L 1 G A L 7和 G A L 10 基因編碼 外源基因在酵母中表達(dá)的限制因素 外源基因穩(wěn)態(tài) mRNA的濃度 外源基因 mRNA的翻譯活性 酵母菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性 在釀酒酵母中 ， 高豐度的蛋白質(zhì) （ 如甘油醛 3磷酸脫氫酶 GAPDH、 磷酸甘油激酶 PKG、 乙醇脫氫酶 ADH） 中 96% 以上的氨基酸是由 25個(gè)密碼子編碼的。 酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 釀酒酵母的基因表達(dá)系統(tǒng)最為成熟，包括轉(zhuǎn)錄活性較高的甘油 醛 3磷酸脫氫酶基因 GAPDH、 磷酸甘油激酶基因 PKG、 乙醇脫氫 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng) 酶基因 ADH所屬的啟動(dòng)子，多種重組外源蛋白獲得成功表達(dá)。 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的最大問(wèn)題在于其 超糖基化 能力，往往使得 有些重組蛋白（如人血清白蛋白等）與受體細(xì)胞緊密結(jié)合，而不能 大量分泌。這一缺陷可用非釀酒酵母型的表達(dá)系統(tǒng)來(lái)彌補(bǔ)。 酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 乳酸克魯維酵母的雙鏈環(huán)狀質(zhì)粒 pKD1已被廣泛用作重組異源 蛋白生產(chǎn)的高效表達(dá)穩(wěn)定性載體 ， 即便在無(wú)選擇壓力的條件下 ， 也 乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng) 能穩(wěn)定遺傳 40代以上。 乳酸克魯維酵母表達(dá)分泌型和非分泌型的重組蛋白 ， 性能均優(yōu) 于釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。 酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 巴斯德畢赤酵母是一種 甲基營(yíng)養(yǎng)菌 ， 能在低廉的含甲醇培養(yǎng)基中生 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng) 長(zhǎng) ， 甲醇 可高效誘導(dǎo)甲醇代謝途徑中各酶編碼基因的表達(dá) ， 因此生長(zhǎng)迅 速 、 乙醇氧化酶基因 AOX1所屬?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子 、 表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢 赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)。但甲醇 易揮發(fā) ，操作條件差。 由于巴斯德畢赤酵母沒(méi)有合適的自主復(fù)制型載體 ， 所以外源基因的 表達(dá)序列一般 整合 入受體的染色體 DNA上 。 在此情況下 ， 外源基因的 有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的重組蛋白在巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中獲得成功表達(dá)。 高效表達(dá)在很大程度上取決于整合 拷貝數(shù) 的多寡 。 目前已有 50余種具 酵母表達(dá)系統(tǒng)的選擇 多型漢遜酵母也是一種 甲基營(yíng)養(yǎng)菌 。 其自主復(fù)制序列 HARS已被克 多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng) 隆 ， 并用于構(gòu)建克隆表達(dá)載體 ， 但與巴斯德畢赤酵母相似 ， 這種載體在 受體細(xì)胞有絲分裂時(shí)顯示出不穩(wěn)定性 。 所不同的是 ， HARS質(zhì)粒 能高頻 自發(fā)地整合在受體的染色體 DNA上 ， 甚至可以連續(xù)整合 100多個(gè)拷貝 ， 目前 ， 包括乙型肝炎表面抗原在內(nèi)的數(shù)種外源蛋白在該系統(tǒng)中獲得 因此重組多型漢遜酵母的構(gòu)建也是采取整合的策略。 成功表達(dá)。 F 利用重組 酵母生產(chǎn)乙肝疫苗 6 外源基因在酵母中的表達(dá) 由 乙型肝炎病毒 （ HBV） 感染引起的急慢性乙型肝炎是一種嚴(yán)重 的傳染病 ， 每年約有 200萬(wàn) 病人死亡 ， 并有 3億 人成為 HBV攜帶者 ， 其 中相當(dāng)一部分人可能轉(zhuǎn)化為肝硬化或肝癌患者 。 目前對(duì)乙型肝炎病毒 還沒(méi)有一種有效的治療藥物 ， 因此高純度乙型疫苗的生產(chǎn)對(duì)預(yù)防病毒 感染具有重大的社會(huì)效益 ， 而利用重組酵母大規(guī)模生產(chǎn)乙型疫苗為其 廣泛應(yīng)用提供了可靠的保證。 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒 是一種蛋白包裹型的 雙鏈 DNA病毒 ， 具有感染力的病毒顆 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu) 粒呈球面狀 ， 直徑為 42 nm， 基因組僅為 kb。 病毒顆粒的主要結(jié)構(gòu) 蛋白是病毒的 表面抗原多肽 （ HBsAg） 或 S多肽 ， 它具有糖基化和非糖 基化兩種形式 。 顆粒內(nèi)的蛋白成份包括 核心抗原 （ HBcAg） 、 病毒 DNA 除此之外 ， 被乙肝病毒感染的人的肝臟還能合成并釋放大量的 22 聚合酶、微量病毒蛋白。 nm的空殼亞病毒顆粒 ， 其免疫原性是未裝配的各種包裝蛋白組份的 1000倍。包裝蛋白共有三種轉(zhuǎn)膜糖蛋白： S、 M、 L多肽。 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙型肝炎病毒的包裝蛋白編碼基因 ATG ATG ATG TAA 108 aa 55 aa 226 aa preS1 preS2 S S 多肽 226 aa M 多肽 281 aa L 多肽 399 aa 乙型肝炎病毒的結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫 傳統(tǒng)乙肝疫苗的制備 苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來(lái)的。雖然這種質(zhì)膜來(lái)源的 疫苗具有較高的免疫原性，但由于原材料的限制難以大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。 產(chǎn)乙肝表面抗原的重組釀酒酵母 20世紀(jì) 80年代開(kāi)始選擇 釀酒酵母 表達(dá)重組 HBsAg， 主要工作包括 將 S多肽的編碼置于 ADH1啟動(dòng)子控制下 ， 轉(zhuǎn)化子能表達(dá)出具有免疫活 性的重組蛋白 ， 它在細(xì)胞提取物中以球形脂蛋白顆粒的形式存在 ， 平 均顆粒直徑為 22nm， 其結(jié)構(gòu)和形態(tài)均與慢性乙肝病毒攜帶者血清中 的病毒顆粒相同。 目前 ， 由釀酒酵母生產(chǎn)的重組 HBsAg顆粒已作為乙肝疫苗商品化 重組產(chǎn)物的最終產(chǎn)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白量的 1%2%。 進(jìn)一步的研究表明 ， M多肽和 L多肽對(duì) S型疫苗具有顯著的增效作 用 ， 由三者 （ 或兩者 ） 構(gòu)成的復(fù)合型乙肝疫苗還可以誘導(dǎo)那些對(duì) S
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