實驗四__重組蛋白的sds-page(編輯修改稿)
2025-03-12 16:16 本頁面
【文章內容簡介】 裝，－ 20℃ 保存。 樣品緩沖液（ TrisCl， ） 2 1. 蛋白質的二硫鍵是否完全被還原 。 只有在蛋白質分子內的二硫鍵被徹底還原的情況下 ， SDS才能定量地結合到蛋白質分子上去 ， 并使之具有相同的構象 。 所以樣品處理時需加 β 巰基乙醇或二硫蘇糖醇 （ DTT） 。 2. 樣品處理液中 SDS單體的濃度 :為了保證蛋白質與 SDS的充分結合 ，溶液中 SDS的總量至少要比蛋白質高 34倍 ， 甚至 10倍以上 。 3. 樣品處理液的離子強度：應保持較低的離子強度 （ 低于 ） ， 這樣才能保證 SDS有較高的單體濃度 ， 與蛋白質充分結合 。 若樣品的離子強度太高 ， 需先透析或凝膠過濾除鹽 。 4. 樣品中的蛋白質濃度需適當 。 濃度過高 ， 易造成拖尾 ， 甚至影響蛋白質遷移率與分子量對數(shù)的線性關系；濃度太低則不易檢測 。 通常根據(jù)樣品含有的蛋白質種類多少及所使用的檢測方法確定蛋白質濃度 ， 如用考馬斯亮藍染色 ， 每種蛋白的濃度應為 20～ 30μ g /ml,若用銀染 ， 則只需 ～ g /ml。 用樣品緩沖液（ TrisCl， ）配制成每種標準蛋白質濃度均為 /ul的溶液，－ 20℃ 保存。使用前置室溫融化后，沸水浴中加熱 35分鐘后上樣。 配置貯備溶液 A 30%Acr/1%Bis 貯液： Acr 30 g Bis g 溶于去離子水，定容至 100mL。棕色瓶 4℃ 保存。 B. 分離膠緩沖液 （ M TrisCl pH ）： Tris Base M ddH2O 750 mL HCl 加至 pH ddH2O 至 1000 mL C. 濃縮膠緩沖液 （ 1M TrisCl ）： Tris Base ddH2O 200 mL HCl 加至 ddH2O 至 250 mL D. 10 % SDS ： SDS 10g ddH2O 至 100mL E. 10 %AP： AP 1g ddH2O 至 10mL F. TEMED G. 10 SDS電極緩沖液 ()： Tris base () 250mM Glycine (FW ) 2M SDS () 1% (W/V) ddH2O to 100mL I. 固定染色液： 考馬斯亮藍 R250 95%乙醇 250mL 冰醋酸 50mL ddH2O 200mL K. 脫色液： 95%乙醇 250mL 冰醋酸 80mL ddH2O 1000mL 安裝垂直板電泳槽 分離膠制備 12％ , 配 10ml,加至距梳齒 ， 上覆蓋 1－ 2mm與水飽和的異丁醇 。 濃縮膠制備 5%， 配 4ml,插入加樣梳 ， 靜置 30分鐘 1小時使其凝合 。 3. 試驗操作 F i nal G el C o nc ent r at i o n 5% 7. 5% 10% 12 % 15% 3 0 % A c r / 1% B i s 貯液 ( m L ) 1. 61 2. 42 3. 22 4 .0 4. 84 1. 5 M 分離膠緩沖液 ( m L ) 2. 5
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