sds-page檢測重組蛋白(編輯修改稿)
2025-08-03 12:04 本頁面
【文章內容簡介】 速度相等的穩(wěn)態(tài)建立后，二者之間形成一個穩(wěn)定而又不斷向陽極移動的界面，而蛋白質的有效遷移率在快慢離子之間，因此也就聚集在這個移動附近，被壓縮成一個狹小的中間層。蛋白質（亞基）分子量的測定蛋白質SDS膠束在水溶液中的形態(tài)，就像一個長橢圓棒，橢圓棒的短軸對不同的蛋白質亞基SDS膠束而言，基本上都是相同的， nm。但長軸的長度則與亞基分子量的大小成正比。因此這種膠束在進行SDSPAGE時，電泳遷移率不再受到蛋白質原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即取決于蛋白質或亞基分子量的大小。當蛋白質亞基的分子量在15~200 kDa之間時，電泳遷移率與分子量的對數呈線性關系。由此可見，SDSPAGE不僅可以分離蛋白質，而且可以根據遷移率大小測定蛋白質亞基的分子量。蛋白質或亞基分子量的測定，可根據蛋白質標準（蛋白質Marker）測定，或根據相對遷移率進而更精確地測定分子量。現(xiàn)在市售的蛋白質Marker大多是由一系列純化的、具有不同分子量的蛋白質組成的，它們之間不會發(fā)生相互作用，在進行SDSPAGE時具有良好的線性關系。例如本實驗中采用的低分子量蛋白質Marker為BBI公司產品，由磷酸酶b（兔子肌肉）、牛血清蛋白（牛）、卵清蛋白（雞蛋白）、碳酸苷酶（牛）、溶菌酶（雞蛋白）五種蛋白質組成， kD， kD， kD， kD， kD。在電泳時，將蛋白質Marker點入與樣品相鄰的泳道，其各蛋白質組分將在電泳過程中相互分離。根據分子量相近的蛋白質具有相近的遷移率這一原則，可以借助于蛋白質Marker初步確定目的蛋白的分子量。為了在電泳時即時觀察蛋白質的分離情況，還可以采用已經經過著色的蛋白質Marker，通常稱為“彩虹”蛋白質Marker。另外，我們還可以根據蛋白質Marker中各種蛋白質的相對遷移率，作出標準曲線，從而更精確地測定目的蛋白的分子量。蛋白質的遷移距離，即從分離膠的上沿至蛋白帶的中央的距離，可以用直尺直接測得，而蛋白質的相對遷移率Rf是用每個蛋白帶的遷移距離除以溴酚藍的遷移距離得到，即：Rf = 蛋白帶的遷移距離/溴酚藍的遷移距離如果凝膠厚度大于1mm，由于染色、脫色和保存過程中凝膠的膨脹或收縮，所以必須測量固定前和干燥后的凝膠的尺寸來消除這種誤差，其公式為：Rf =（蛋白帶的遷移距離/干燥后的凝膠長度）（固定前的凝膠長度/溴酚藍的遷移距離）用每個標準蛋白的分子量的對數（縱坐標）對它的相對遷移率（橫坐標）作圖就能得到一條直線。量出目的蛋白的遷移距離，計算出相對遷移率，就可以根據標準曲線計算出其分子量。不同，這樣的標準曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量的測定才具有可靠性。此外，使用凝膠掃描或影像文件處理系統(tǒng)，便可以很快讀出目的蛋白的分子量。三、實驗材料生物材料 經IPTG誘導的含有重組質粒pET28aegfp，pET28arfp或pET28a
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