基因工程的下游技術(shù)重組蛋白的表達(dá)、純化和分析(編輯修改稿)
2025-01-25 17:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 基和巰基的肽和蛋白質(zhì)。 ? 過渡金屬元素鎳在較低 pH范圍時 （ pH 68） ， 有利于選擇性地吸附帶咪唑基和巰基的肽和蛋白質(zhì) 。 在堿性 pH時吸附更有效 ，但選擇性降低 。 ? 金屬螯合親和層析在很大程度上 ， 由被吸附的肽和蛋白質(zhì)分子表面咪唑基和巰基的稠密程度所支配 ， 吲哚基可能也很重要 。 ? 用 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白質(zhì)含有特定的組氨酸標(biāo)簽 ， 這種可溶性蛋白質(zhì)能用金屬親和層析法進(jìn)行分離 ， 且操作簡單 ， 快速 ， 純化效率高 。 三． 材料與試劑 1. 材料 2. 含 pUC18質(zhì)粒工程菌及含重組 pGFPuv質(zhì)粒工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞裂解蛋白。 2. 試劑 ① ② 2mol/L NaCl 溶液 50mL ③ 1mol/L NaOH溶液 50mL ④ ⑤ 起始緩沖液： 50mmol/L TrisHCl。 500mmol/L NaCl。 500mL ⑥ Chelating Sepharose Fast Flow 45 mL ⑦ 大腸桿菌細(xì)胞裂解蛋白樣品 1020mL ⑧ 洗滌液： 50mmol/L咪唑； 50mmol/L TrisHCl； ， pH ⑨ 洗脫液： 300mmol/L咪唑； 50mmol/L TrisHCl； ， 四． 實驗儀器 X 50cm層析柱、自動分部收集器、紫外分光光度計、紫外檢測儀及記錄儀等。 五． 操作步驟 1. 樣品的制備 : 2. 細(xì)胞的培養(yǎng)及熒光蛋白表達(dá)見實驗十，細(xì)胞的破碎及蛋白的收集如下： 收集在 25℃ 培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)液， 5000r/min，離心 10min， 去上清液，菌體用起始緩沖液洗滌一次，離心收集菌體，用三分之一（細(xì)胞培養(yǎng)液）體積（ 15mL）的起始緩沖液充分懸浮，冰浴下進(jìn)行超聲波處理，功率為 400W， 工作 4秒，間隙 4 秒，為一次，99次為一周期。共處理六周期。然后8000r/min,離心 30min， 取上清液。放冰箱備用。 2. 親和層析柱的安裝 把層析柱固定在鐵支架上 ， 柱下端出口封閉 。 加入少量的無離子水 ， 排去下端的空氣泡 。 取出 20%乙醇浸泡的螯合凝膠4mL到燒杯中 ， 加入少量的無離子水制成糊狀 ， 沿著貼緊柱內(nèi)壁的玻璃棒把糊狀凝膠倒進(jìn)柱內(nèi) ， 打開下端的排水口 ， 讓親和凝膠劑隨水流自然沉下 。 親和層析劑為 45mL。 3. 親和凝膠的再生處理： ① 用 10 倍柱體積的再生溶液（ 、 ） 過柱，流速 3mL/min。 1drops/2s! ② 用 5倍柱體積的 2 mol/L NaCl 溶液洗親和層析柱除去多余的 EDTA。流速 3mL/min。 ③ 用 5倍柱體積的 1 mol/L NaOH溶液洗滌層析柱，流速 2mL/min。 ④ 用 10倍柱體積的無離子水洗至 pH89， 流速3mL/min。 ⑤ 用 2倍柱體積的 ，使凝膠金屬鎳離子結(jié)合 , 流速 2mL/min。過完后放置 5 分鐘。 ⑥ 用 10倍柱體積的無離子水洗滌層析柱除去多余的鎳離子。流速 3mL/min。 ⑦ 用 5 倍柱體積的起始緩沖溶液平衡層析柱，備用。 4. 上樣： 先從 15mL裂解上清液中取出 50181。L準(zhǔn)備用于電泳 ， 作為親和層析分離前上清液中的總蛋區(qū)帶對照圖譜 （ Sample3） 。 然后以每分鐘 1mL的流速上層析柱 ， 分部收集流出液 ， 每管 3mL，（ 測得的 OD280值曲線為穿流峰 ， 取最高的一管樣品液用作電泳 ， 標(biāo) Sample4） 。 再用 10mL起始緩沖液過層析柱 ， 操作同前 。 5. 洗滌： 用含 50 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液 25mL洗脫， 分部收集洗脫液 ， 每管 5mL， 取中間管樣品電泳 （ Sample5） 。 6. 洗脫： 用含 300mmol/L咪唑的洗脫緩沖液 10mL洗脫， 用 Ep管分部收集洗脫液 。 每管收 。 （測得的 OD280值曲線峰為目的蛋白峰 GFP， 標(biāo)Sample6 ） 。 7. 12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測： 進(jìn)行 12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測親和層析分離純化的結(jié)果 。 Sample16， 外加 Marker（ 見實驗十一 ） 。 六． 注意事項 1. 不管是裝柱還是上樣、洗脫，在整個操作過程中，水或溶液面都不能低于凝膠柱平面。否則，凝膠柱會產(chǎn)生氣泡，就會影響層析效果。 2. 樣 品上柱和洗脫過程，其流速都要慢，分離效果才好。 3. 親和層析劑可回收，經(jīng)再生可循環(huán)使用。該親和層析劑用 20%乙醇浸泡于冰箱保存。 4. 親和層析柱在再生處理、上樣、洗脫過程中其顏色都有明顯變化（白、藍(lán)、綠），只要細(xì)心操作，樣品是否被吸附上去或被洗脫下來？都能觀察到從而作出判斷。 七． 實驗安排 先用母液配制其它未配制溶液，再生鎳柱；然后，過柱純化重組蛋白。 八． 思考與討論 1. 解釋 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的熒光蛋白經(jīng)12％ SDSPAGE電泳結(jié)果圖譜。 2. 鎳柱在再生處理、上樣、洗脫過程中其顏
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