【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 大腸桿菌(Escherichia coli)和福氏志賀菌（Shigelle flexneri）2) 培養(yǎng)基 葡萄糖銨培養(yǎng)基(附錄Ⅲ8),普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，無(wú)菌生理鹽水8mL(二支)．四、方法與步驟1） 做標(biāo)記 取葡萄糖銨培養(yǎng)基、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面、無(wú)菌生理鹽水個(gè)2支，分別于其上做好培養(yǎng)基名稱和菌名等標(biāo)記。2） 制備菌懸液 將苗種相應(yīng)接人理鹽水管內(nèi)，研磨并攪動(dòng)使其均勻。要求每一接種環(huán)內(nèi)含菌數(shù)在20—100個(gè)為宜（或肉眼觀察不見渾濁）。3） 接種 用無(wú)菌接種環(huán)分別取大腸桿菌菌液一環(huán)，在對(duì)應(yīng)的葡萄糖銨斜面培養(yǎng)基和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上劃線接種，并以同樣的方法接種福氏志賀菌。4） 培養(yǎng) 將種接好的試管置36℃土1℃恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在葡萄糖銨斜面上有正常大小菌落生長(zhǎng)者為葡萄糖銨試驗(yàn)陽(yáng)性，記“十”號(hào)；不生長(zhǎng)或只生長(zhǎng)為極微小的菌落，而在對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好者，為陰性，否則記“一”。將觀察結(jié)果以表格方式記錄。實(shí)驗(yàn)六 酪蛋白分解試驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? (1)了解酪蛋白分解試驗(yàn)的用途及原理． (2)學(xué)習(xí)酪蛋白分解試驗(yàn)的操作技術(shù)． 二、原理 某些菌具有酪蛋白分解酶，而有的菌則不具有。具有酪蛋白分解酶的細(xì)菌在 蛋白瓊脂平板上可分解酪蛋白而令菌落周圍形成透明圈。三、實(shí)驗(yàn)材料（1）菌種 蠟樣牙孢桿菌和球形芽孢桿菌。(2) 培養(yǎng)基 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板(附錄Ⅲ—19)(3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等。四、方法與步驟以劃線接種法將試驗(yàn)菌接種于酪蛋白培養(yǎng)基上，然后置37℃恒溫箱培養(yǎng)1—2d后，觀察結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果平板中菌落周圍有透明圈者，為酪蛋白分解試驗(yàn)陽(yáng)性。反之為陰性．***注：培養(yǎng)基在倒時(shí)要搖勻（因?yàn)槔业鞍撞蝗芙猓? 倒好后，培養(yǎng)基放置時(shí)間要較長(zhǎng)（凝固時(shí)間較長(zhǎng)）實(shí)驗(yàn)七 細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? (1)了解細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)的用途與原理． (2)學(xué)習(xí)細(xì)胞色素氧化酶試驗(yàn)的操作技術(shù)． 二、原理 在不以氧為直接受氫體的生物氧化體系中，生物氧化需要在多種酶聯(lián)合作用下方能進(jìn)行。組成這類生物氧化體系的酶，主要是細(xì)胞色素類酵。這種酶在有分子氧與脫氫酶的存在下，可氧化二甲基對(duì)苯撐二胺和α—萘酚成吲哚酚藍(lán)，其反應(yīng)式同氧化酶試驗(yàn)．三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草桿菌(13acill~subtilis)。 (2)試劑 同氧化酶試驗(yàn)。四、方法與步驟 取37℃培養(yǎng)20h的斜面培養(yǎng)物一支，將兩種試劑各2—3滴順斜面從上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑混合液流經(jīng)斜面上的培養(yǎng)物。如系平板培養(yǎng)物，則可用試劑混合液滴到菌落上。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在兩分鐘內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色者為陽(yáng)性，2min以后出現(xiàn)微弱或可疑反應(yīng)者均作為陰性結(jié)果. 實(shí)驗(yàn)九 淀粉水解試驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? (1)了解淀粉水解試驗(yàn)的原理及用途。 (2)學(xué)習(xí)淀粉水解試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理 許多菌產(chǎn)生淀粉酶，能把培養(yǎng)基中的淀粉水解為無(wú)色糊精的等小分子，或進(jìn)—分解為麥芽糖和葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再變藍(lán)色．三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoil)和枯草芽抱桿酶(Bacillussubtilis)。 (2)培養(yǎng)基 %的可溶性淀粉。 (3)試劑 路哥氏碘液(附錄1—3．2)‘ (4)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。 四，方法與步驟 將培養(yǎng)基熔化，倒成平板，凝固后，取菌種點(diǎn)種于平板上，每皿可點(diǎn)3—5個(gè)菌，37℃恒溫箱培養(yǎng)2—4d后，觀察結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果取培養(yǎng)好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍(lán)色，而菌落周圍如有無(wú)色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已被水解，稱淀粉水解試驗(yàn)陽(yáng)性。透明圈的大小一般說明水解淀粉能力的大小。實(shí)驗(yàn)八 過氧化氫酶試驗(yàn)—，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)了解過氧化氫酶試驗(yàn)的用途與原理。2)學(xué)習(xí)過氧化氫酶試驗(yàn)的操作技術(shù)。二、原理 在以需氧脫氫酶催化的氧化體系中，氧原子接受電子后，即與溶液中氫離子結(jié)合，生成過氧化氫，此物對(duì)微生物有毒性。有的菌具有過氧化氧酶，可將其分解成水和氧，但有的菌不具有此酶．故過氧化氫酶試驗(yàn)是鑒別菌種的依據(jù)之一。 三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和某種乳酸桿菌(Lactobacillus sp)。 (2)培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基(附錄Ⅱ—1．1),麥汁培養(yǎng)基. (3)試劑 3%過氧化氫溶液． (4)其它 酒精棉球，酒精燈，潔凈小試管，接種環(huán)等。四、方法與步驟從斜面挑取一環(huán)菌種置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液約2mL,觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果于半分鐘內(nèi)產(chǎn)生氣泡者，為過氧化氧酶試驗(yàn)陽(yáng)性；不發(fā)生氣泡者，為陰性。菌落總數(shù)測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中菌落總數(shù)的測(cè)定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中菌落總數(shù)的測(cè)定。2 術(shù)語(yǔ)與定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 菌落總數(shù) 食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后（培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、PH、需氧性質(zhì)等），所得1ml（或1g）檢樣中形成菌落的總數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)條件下所得結(jié)果，只包括一群在平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數(shù)。3 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱：36℃177。1℃，30℃177。1℃。 冰箱：2℃~5℃. 恒溫水浴箱：46℃177。1℃. 天平：. 均質(zhì)器。 振蕩器。 無(wú)菌吸管：1ml（）、10 ml（）或微量移液器及吸頭。 無(wú)菌錐形瓶：容量250ml、500ml。 無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm PH計(jì)或PH比色管或精密PH試紙。 放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器或petrifilm自動(dòng)判讀儀。4 培養(yǎng)基和試劑4. 1 平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：見第A..1章。4. 2 磷酸鹽緩沖液：見第A..2章。4. 3 無(wú)菌生理鹽水：，121℃高壓滅菌15min。 1mol/L氫氧化鈉（NaOH）：稱取40g氫氧化鈉溶于1000ml蒸餾水中。 1mol/L鹽酸（HCL）:移取濃鹽酸90ml用蒸餾水稀釋1000ml。 petrifilm菌落總數(shù)測(cè)試片和壓板。第一法 平板菌落計(jì)數(shù)法5 檢驗(yàn)程序 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序見圖1檢樣25g（或25 ml）樣品+225ml稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個(gè)~3個(gè)適宜樣品勻液，各取1ml分別加入無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)每皿中加入15ml~20ml平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，混勻 培 養(yǎng)36℃177。1℃48h177。2h計(jì)數(shù)各平板菌落數(shù) 計(jì)數(shù)菌落總數(shù)報(bào) 告 圖1 菌落總數(shù)的檢驗(yàn)程序6 操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取25g樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 000r/min~10 000r/min 均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225ml稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1：10的樣品勻液。液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25ml樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1：10的樣品勻液。用1ml無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用一支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用一次1ml無(wú)菌吸管或吸頭。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)。同時(shí)分別取1ml稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿左空白對(duì)照。及時(shí)將15ml~20ml冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃177。1℃恒溫水浴箱中）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。培養(yǎng) 瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃177。1℃培養(yǎng)48h177。2h。水產(chǎn)品30℃177。1℃培養(yǎng)72h177。3h. 如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4ml），凝固后翻轉(zhuǎn)平板。 菌落計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colonyforming units,CFU）表示。 選取菌落數(shù)在30CPU~300CPU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。 當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。7 結(jié)果的表述 菌落總數(shù)的計(jì)算方法 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每克（或毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。 若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式（1）計(jì)算： 式中： N樣品中菌落數(shù)； ∑C平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和； n1 第一個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)； n2第二個(gè)適宜稀釋度平板上的菌落數(shù)； d 稀釋因子（第一稀釋度）。示例： 稀釋度1；100（第一稀釋度）1；100（第二稀釋度）菌落數(shù)232，24433，35，則對(duì)所有稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)（包括液體樣品原液）的平板均無(wú)菌落數(shù)生成，則以少于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。~300之間，其中一部分小于30或大于300時(shí)，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。 菌落總數(shù)的報(bào)告，按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數(shù)字報(bào)告。 大于或等于100時(shí)，第三位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取用兩位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式表示，按四舍五入原則修約后，采用兩位有效數(shù)字。 若所有平板上蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。 若空白對(duì)照有菌落生成，則這次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。 稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/ml為單位報(bào)告。第二法菌落總數(shù)Petrifilm TM測(cè)試片法8 檢驗(yàn)程序除將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基改成PetrifilmTM 菌落總數(shù)測(cè)試片外，其他與第5 章相同。9 操作步驟 樣品的稀釋 制備1:10 的樣品勻液后，用1 mol/L 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸( HCL ）調(diào)節(jié)pH 。 接種根據(jù)對(duì)樣本污染狀況的估計(jì)，選擇2 個(gè)~3 個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液進(jìn)行檢驗(yàn)。將測(cè)試片置于平坦實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面，揭開上層膜，用吸管或微量移液器吸取1 mL 樣品勻液，垂直滴加在測(cè)試片的中央，將上層膜蓋下，允許上層膜直接落下，但不要滾動(dòng)上層膜，將壓板（凹面底朝下）放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)膜上，切勿扭轉(zhuǎn)壓板。拿起壓板，靜置至少1 min 以使培養(yǎng)基凝固。每個(gè)稀釋度接種兩張測(cè)試片。 培養(yǎng)將測(cè)試片的透明面朝上，水平置于培養(yǎng)箱內(nèi)?？啥询B至20 片， 。 計(jì)數(shù) 培養(yǎng)結(jié)束后立即計(jì)數(shù)，可肉眼觀察計(jì)數(shù)，或用菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡、PetrifilmTM 自動(dòng)判讀儀計(jì)數(shù)。選取菌落數(shù)在30 300 之間的測(cè)試片計(jì)數(shù)。 計(jì)數(shù)所有紅色菌落。細(xì)菌濃度很高時(shí)，整個(gè)測(cè)試片會(huì)變成紅色或粉紅色，將結(jié)果記錄為“多不可計(jì)”。 有時(shí)，當(dāng)細(xì)菌濃度很高時(shí)，測(cè)試片中央沒有可見菌落，但圓形培養(yǎng)膜的邊緣有許多小的菌落，其結(jié)果也記錄為“多不可計(jì)”；進(jìn)一步稀釋樣品可獲得準(zhǔn)確的讀數(shù)。 某些微生物會(huì)液化凝膠，造成局部擴(kuò)散或菌落模糊的現(xiàn)象。如果液化現(xiàn)象干擾計(jì)數(shù)，可以計(jì)數(shù)未液化的面積來估算菌落數(shù)。10 結(jié)果的表述同第7章附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑A 1 平板計(jì)數(shù)瓊脂(plate count agar，PcA)培養(yǎng)基A 1 1成分 胰蛋白胨 g 酵母浸膏 g 葡萄糖 g 瓊脂 g 蒸餾水 1 000 mL pH A 1 2制法 將上述成分加于蒸餾水巾A 2磷酸鹽緩沖液A 2 1成分 磷酸二氫鉀(KH2P04) 蒸餾水 PH A 2 2制法GB／T 4789 2—2∞8煮沸溶解，調(diào)節(jié)PH。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15 min500mL 貯存液： g的磷酸_二氫鉀溶于500mL蒸餾水中， mL的1 mol／1．氫氧化鈉溶，蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。 稀釋液： mL，用蒸餾水稀釋至l 000 mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15 min。大腸桿菌計(jì)數(shù)1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群計(jì)數(shù)的方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。2 術(shù)語(yǔ)和定義 下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。