【正文】 ＼COOH CHOH CO NH3 N=CHCH3 ︱ ︱ CH3 CH3三、實驗材料 (1)菌種 大腸埃希氏菌(Escherichia coli),枯草芽孢桿菌(Bacillus subttilis)的斜面菌種。 (2)．接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌至以上相應試管中，空白對照管不接菌，置37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24℃ 48 h。注意：原試管中留下的培養(yǎng)液用作甲基紅試驗。三、實驗材料 (1)菌種 (2)培養(yǎng)基 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。二、原理 有些細菌含有色氨酸酶。 (2)培養(yǎng)基 蛋白胨水培養(yǎng)基。置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24~48 h。實驗七 β—半乳糖苷酶試驗一、實驗目的了解β半乳糖苷酶試驗的用途與原理：學習β半乳糖苷酶試驗的操作技術(shù)。四、方法與步驟 取ONFG培養(yǎng)基試管三支，于其上分別做好培養(yǎng)基名稱和“大腸桿菌”、“愛檀華氏苗”、“空白對照”等標記，然后分別將試驗菌相應地接人ONPG培養(yǎng)基中，連同對照，置36℃土1℃培養(yǎng)1～3h和24h，觀察結(jié)果。做這項測定的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方很多，因酶的種類而異．培養(yǎng)基可制成液體分裝試管，％一2％水洗瓊脂制成平板。有些底物不宜加壓滅菌，可用過濾法滅菌后加入無菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，某些醇類和酚類則不需滅菌。四、方法與步驟將實驗菌種首先制成懸液，以避免帶人少量碳源而干擾實驗結(jié)果．平板接種用接種環(huán)點種，液體培養(yǎng)基用直針接種．每一測定苗都必須接種未加碳水化合物的空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基作對照。實驗四 丙二酸鹽試驗一、實驗目的了解丙二酸鈉試驗的用途及原理．學習丙二酸試驗的操作技術(shù)。然后對應地將菌種接入丙二酸鈉培養(yǎng)基試管中，連同空白對照置于37℃恒溫箱培養(yǎng)48h，觀察結(jié)果。2)學習掌握葡萄糖銨試驗的操作技術(shù)。3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，無菌生理鹽水8mL(二支)．四、方法與步驟1） 做標記 取葡萄糖銨培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂斜面、無菌生理鹽水個2支，分別于其上做好培養(yǎng)基名稱和菌名等標記。4） 培養(yǎng) 將種接好的試管置36℃土1℃恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。具有酪蛋白分解酶的細菌在 蛋白瓊脂平板上可分解酪蛋白而令菌落周圍形成透明圈。反之為陰性．***注：培養(yǎng)基在倒時要搖勻（因為酪蛋白不溶解） 倒好后，培養(yǎng)基放置時間要較長（凝固時間較長）實驗七 細胞色素氧化酶試驗 一、實驗目的 (1)了解細胞色素氧化酶試驗的用途與原理． (2)學習細胞色素氧化酶試驗的操作技術(shù)． 二、原理 在不以氧為直接受氫體的生物氧化體系中，生物氧化需要在多種酶聯(lián)合作用下方能進行。四、方法與步驟 取37℃培養(yǎng)20h的斜面培養(yǎng)物一支，將兩種試劑各2—3滴順斜面從上端滴下，并將斜面略加傾斜，使試劑混合液流經(jīng)斜面上的培養(yǎng)物。二、原理 許多菌產(chǎn)生淀粉酶，能把培養(yǎng)基中的淀粉水解為無色糊精的等小分子，或進—分解為麥芽糖和葡萄糖。 四，方法與步驟 將培養(yǎng)基熔化，倒成平板，凝固后，取菌種點種于平板上，每皿可點3—5個菌，37℃恒溫箱培養(yǎng)2—4d后，觀察結(jié)果五、實驗結(jié)果取培養(yǎng)好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以鋪滿菌落周圍為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已被水解，稱淀粉水解試驗陽性。二、原理 在以需氧脫氫酶催化的氧化體系中，氧原子接受電子后，即與溶液中氫離子結(jié)合，生成過氧化氫，此物對微生物有毒性。四、方法與步驟從斜面挑取一環(huán)菌種置于潔凈試管內(nèi)，滴加3%過氧化氫溶液約2mL,觀察結(jié)果。2 術(shù)語與定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。1℃，30℃177。 振蕩器。 放大鏡或菌落計數(shù)器或petrifilm自動判讀儀。 1mol/L氫氧化鈉（NaOH）：稱取40g氫氧化鈉溶于1000ml蒸餾水中。1℃48h177。，制備10倍系列稀釋樣品勻液。及時將15ml~20ml冷卻至46℃的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于46℃177。2h。 菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應的菌落數(shù)量。每個稀釋度的菌落數(shù)應采用兩個平板的平均數(shù)。7 結(jié)果的表述 菌落總數(shù)的計算方法 若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數(shù)，作為每克（或毫升）中菌落總數(shù)結(jié)果。~300之間，其中一部分小于30或大于300時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。 若空白對照有菌落生成，則這次檢測結(jié)果無效。 接種根據(jù)對樣本污染狀況的估計，選擇2 個~3 個適宜稀釋度的樣品勻液進行檢驗。 培養(yǎng)將測試片的透明面朝上，水平置于培養(yǎng)箱內(nèi)。 計數(shù)所有紅色菌落。如果液化現(xiàn)象干擾計數(shù)，可以計數(shù)未液化的面積來估算菌落數(shù)。大腸桿菌計數(shù)1 范圍 本標準規(guī)定了食品中大腸菌群計數(shù)的方法。該菌群主要來源于人畜糞便，作為糞便污染指標評價食品的衛(wèi)生狀況，推斷食品中腸道致病菌污染的可能。 冰箱：2℃～5℃。 均質(zhì)器。 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。煌綠乳糖膽鹽（brilliant green lactose bile，BGLB）肉湯：。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 第一法 大腸菌群MPN計數(shù)5 檢驗程序 檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì) 大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗程序見圖110倍系列稀釋 選擇適宜三個連續(xù)稀釋度的樣品勻液，接種LST肉湯管 36℃＋1℃ 48h177。 ～，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L鹽酸（Hcl）調(diào)節(jié)。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全程不過15min。記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。1℃培養(yǎng)48h177。2h 計數(shù)典型和可疑菌落 BGLG肉湯或復發(fā)試驗 報告結(jié)果 36℃＋1℃ 48h177。 及時將15mL～20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。 平板菌落數(shù)的選擇 選取菌落數(shù)在30～150之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即報告為大腸菌群陽性。2h 計數(shù)紅色帶氣泡的的菌落的菌落報告結(jié)果 圖3 大腸菌群PetrifilmTM測試片計數(shù)法程序圖 GB/—2008 10 操作步驟 樣品的稀釋 。拿起壓板，靜置至少1min以使培養(yǎng)基凝固。10. 2. 2 判讀 培養(yǎng)24h177。當培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡，大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明大腸菌群的濃度較高，需要進一步稀釋樣品以獲得更準確的讀數(shù)。計數(shù)菌落數(shù)大于150的測試片時，可計數(shù)一個或兩個具有代表性的方格內(nèi)的菌落數(shù)，換算成單個方格內(nèi)的菌落數(shù)后乘以20即為測試片上估算的菌落數(shù)（圓形生長面積為20cm2）。煮沸2min，將培養(yǎng)基冷卻至45℃~50℃傾注平板。GB/T 附錄B（規(guī)范性附錄）大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表每克（或毫升） 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表陽性管數(shù)MPN95%可信限陽性管數(shù)MPN95%可信限下限上限下限上限000000111111112222220011230001122300011101010001201010012012﹤11111115161420152027——11181838181838203842424238424242429422222333333333333333222330001111222233330120101201230123012321283529362338644375120160931502102902404601100﹥11001791737401837409042901804204294949494941101801802004204204204204301000100020004100—— 注1：本表采用3個稀釋度〔（）、()〕〕,每個稀釋度接種3管 注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g(或1ml)、()()時，表內(nèi)數(shù)字應相應降低10倍；()、()、()時，則表內(nèi)數(shù)字相應增高10倍，其余類推。 2. 1 冰箱:2℃~5℃ 2. 2 恒溫培養(yǎng)箱:36℃士1℃,42℃士1℃ 2. 3 均質(zhì)器。 2. 8 無菌培養(yǎng)皿:直徑90 mm 2. 9 無菌試管:3 mmX50 mm,10 mmX75 mm 2. 10 無菌毛細管。 3. 3 亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液:見第A. 3章。 3. 7 科瑪嘉沙門氏菌屬顯色培養(yǎng)基z 3. 8 三糖鐵(TSI)瓊脂:見第A. 7章。 3. 12 賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基:見第A. 11章。 ⑵由法國科瑪嘉公司提供的產(chǎn)品的商品名。 3. 14 鄰硝基酚β－D半乳糖昔(ONPG)培養(yǎng)基:見第A. 13章。 3. 18 API 20E生化鑒定試劑盒或VITEK GNI生化鑒定卡’。1℃18h~24H36℃177。如需要，測定pH值，用1 mol/ml無菌氫氧化鈉或鹽酸調(diào)pH至 6. 。有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變 HE瓊脂藍綠色或藍色，多數(shù)菌落中心黑色或幾乎全黑色。在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫梭酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)，沙門氏菌屬的反應 結(jié)果見表20 表2沙門氏菌屬在三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫梭酶試驗培養(yǎng)基內(nèi)的反應結(jié)果 三糖鐵瓊脂賴氨酸脫梭酶試驗培養(yǎng)基初步判斷斜面底層產(chǎn)氣硫化氫—++(一)+(一)+可疑沙門氏菌屬—++(一)+(一)_可疑沙門氏菌屬+++(一)+(一)+可疑沙門氏菌屬+++/一+/一_非沙門氏菌注:+陽性，一陰性。 其他的反應結(jié)果均有沙門氏菌屬的可能，同時也均有不是沙門氏菌屬的可能。將已挑菌落的平板儲存 于2℃177。氰化鉀和賴氨酸脫羧酶3項中有1項異常。 5. 4. 2. 3反應序號A3：補做ONPG。 5. 4. 3如選擇API 20E生化鑒定試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)，可根據(jù)5. 4. 1的初步判斷 結(jié)果，從營養(yǎng)瓊脂平板上挑取可疑菌落，用生理鹽水制備成濁度適當?shù)木鷳乙?，使用API 20E生化鑒定 試劑盒或VITEK全自動微生物鑒定系統(tǒng)進行鑒定。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。與食品工業(yè)密切相關(guān)的乳酸菌主要為乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和鏈球菌屬（Streptococcus）中的嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等。 冰箱：2℃～5℃。 無菌吸管：1mL（）、10mL（）或微量移液器及吸頭。 %蔗糖發(fā)酵管：。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。：以無菌操作稱取25g樣品，置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min一10000r/min均質(zhì)1min—2min，制成l:10樣品勻液；或置于裝有225mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min—2min制成1：10的樣品勻液。，選擇2個一3個連續(xù)的適宜稀釋度，使用L形棒進行表面涂布。表 1 乳酸菌計數(shù)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的選擇樣品中所含菌屬 MRS瓊脂平板，36℃土l℃，48hMC瓊脂平板，36℃士