【正文】 大腸菌群 coliforms 一群在36℃條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。每個稀釋度接種兩張測試片。 當平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數(shù)。同時分別取1ml稀釋液加入兩個無菌平皿左空白對照。 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm PH計或PH比色管或精密PH試紙。 (2)培養(yǎng)基肉湯培養(yǎng)基(附錄Ⅱ—1．1),麥汁培養(yǎng)基. (3)試劑 3%過氧化氫溶液． (4)其它 酒精棉球，酒精燈，潔凈小試管，接種環(huán)等。 (2)試劑 同氧化酶試驗。三、實驗材料1) 菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和福氏志賀菌（Shigelle flexneri）2) 培養(yǎng)基 葡萄糖銨培養(yǎng)基(附錄Ⅲ8),普通營養(yǎng)瓊脂斜面。試驗時，往基礎培養(yǎng)基中加糖類1％或醇、％—％，％。五、實驗結(jié)果 如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽性反應，否則為陰性反應，陽性用“+”；陰性用“”表示。培養(yǎng)液→指示劑→珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基pH值下降至pH ，使甲基紅指示劑變紅。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。革蘭氏染色法不僅能觀察到細菌的形態(tài)而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（復染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用G表示。然后再稱取其他各成分依次逐一溶化。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準確。瓶蓋也不要蓋錯。霉菌和酵母菌的pH偏酸；細菌、放線菌的pH為微堿性。G. 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。凡檢查染色標本時，光線應強；檢查未染色標本時，光線不宜太強。因此，一個高的分辨力意味著一個小的可分辨距離，這兩個因素是成反比關系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或納米，這實際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來了。使用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。油鏡的焦距和工作距離（標本在焦點上看得最清晰時，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時，鏡頭離標本十分近，需特別小心。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長越短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來。在對光時，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。培養(yǎng)基除了滿足微生物所必需營養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的酸堿度和滲透壓。另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。1) 液體分裝：分裝高度以試管高度的l／4左右為宜。2．高氏I號培養(yǎng)基配制方法(1) 稱量和溶化 按配方先稱取可溶性淀粉、放入小燒杯中，并用少量冷水將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。二、原理腸桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸等有機酸。此時沿管璧緩慢加入5~10滴吲哚試劑(加人吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察)。 (2)培養(yǎng)基 細菌基礎培養(yǎng)基(附錄Ⅲ—5)。磷酸二銨是唯一的氮源，故以能否在該培養(yǎng)基上生長來作為鑒別有關細菌的依據(jù)之一。這種酶在有分子氧與脫氫酶的存在下，可氧化二甲基對苯撐二胺和α—萘酚成吲哚酚藍，其反應式同氧化酶試驗．三、實驗材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草桿菌(13acill~subtilis)。 三、實驗材料 (1)菌種 大腸桿菌(Escherichia coli)和某種乳酸桿菌(Lactobacillus sp)。 無菌錐形瓶：容量250ml、500ml。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇2個~3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，每個稀釋度分別吸取1ml樣品勻液加入兩個無菌平皿內(nèi)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以，代表一個平板菌落數(shù)。拿起壓板，靜置至少1 min 以使培養(yǎng)基凝固。2 術語和定義 下列術語和定義適用于本標準。 菌落計數(shù)器或Pertrifilm 自動判讀儀。 根據(jù)對樣品污染的狀況估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系稀釋樣品勻液。 平板計數(shù) 選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1mL。將PetrifilmTM大腸菌群測試片置于平坦實驗臺面，揭開上層膜，用吸管吸取1mL樣液垂直滴加在測試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下。 GB/T —2008附錄A(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基和試劑 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯 成分 胰蛋白胨或胰酪胨 氯化鈉 乳糖 磷酸氫二鉀（K3HPO4） 磷酸二氫鉀（KH2PO4） 月桂基磺酸鈉 蒸餾水 1000 ml177。 2. 12全自動微生物鑒定系統(tǒng)(VITEK)1) 3 培養(yǎng)基和試劑 3. 1 緩沖蛋白胨水(BPW):見第A. 1章。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 5. 2增菌 輕輕搖動培養(yǎng)過的樣品混合物,移取1 ml，轉(zhuǎn)種于10 ml TTB內(nèi)，于42℃士1℃培18 h~24 h 同時，另取1 ml，轉(zhuǎn)種于10 ml SC內(nèi)，于36℃士1℃培養(yǎng)18 h ~24 h. 5. 3分離 分別用接種環(huán)取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個BS瓊脂平板和一個XLD瓊脂平板(或HE瓊脂平 板或科瑪嘉顯色培養(yǎng)基平板)。 表3沙門氏菌屬生化反應初步鑒別表反應序號硫化氫(H, S)靛基質(zhì)pH7. 2尿素氰化鉀KCN賴氨酸脫羧酶A1+－－－+A2++－－+A3－－－+/－注：+陽性；－陰性；+（－）陽性或陰性 反應序號A1典型反應判定為沙門氏菌屬。 GB/ 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 雙歧桿菌檢驗3 術語和定義 下列術語和定義適用于本標準。 ①由法國生物梅里埃公司提供的產(chǎn)品的商品名。乳酸菌在MRS和MC培養(yǎng)基上菌落生長形態(tài)特征見表2。 MRS（man rogosa sharpe）培養(yǎng)基：。 本標準適用于含活性乳酸菌的固體、半固體和液體食品中乳酸菌的檢驗。于3 6 ℃ 177。1℃40H~48H 5操作步驟 5. 1前增菌 稱取25 g(ml)樣品放人盛有225 ml BPW的無菌均質(zhì)杯中，以8 000 r/min^10 000 r/min均質(zhì) 1 min^－2 min，或置于盛有225 m工JBPW的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min^}2 min。給出這一信息是為了方便本標準的使用者，并不表示對該產(chǎn)品的認可。 2. 5 電子天平。如果所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)都小于15。例：104樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10104/g（mL）=105CFU/g（CFU/mL）。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群的MPN值。2h 產(chǎn)氣不產(chǎn)氣 大腸桿菌陽性大腸桿菌陰性 查MPN表報告結(jié)果 圖1 大腸菌群MPN計數(shù)檢驗程序6 操作步驟 樣品的稀釋 固體和半固體樣品：稱取25g樣品，放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min，或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1：10的樣品勻液。 無菌吸管：1mL（）、10mL（）或微量移液器吸頭。分裝試管或錐形瓶，121℃高壓滅菌15 min500mL 貯存液： g的磷酸_二氫鉀溶于500mL蒸餾水中， mL的1 mol／1．氫氧化鈉溶，蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。第二法菌落總數(shù)Petrifilm TM測試片法8 檢驗程序除將平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基改成PetrifilmTM 菌落總數(shù)測試片外，其他與第5 章相同。 選取菌落數(shù)在30CPU~300CPU之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。液體樣品：以無菌吸管吸取25ml樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1：10的樣品勻液。 冰箱：2℃~5℃. 恒溫水浴箱：46℃177。實驗八 過氧化氫酶試驗—，實驗目的1)了解過氧化氫酶試驗的用途與原理。(2) 培養(yǎng)基 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板(附錄Ⅲ—19)(3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等。將觀察結(jié)果以表格方式記錄。糖的含量一般為l％，醇類、％％，％。四、方法與步驟標記試管→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄。另取5支空試管相應標記菌名，分別加入35 mL以上對應管中的培養(yǎng)液，再加入400 g／L氫氧化鈉溶液10~20滴，~1 mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶人，置37℃恒溫箱中保溫15℃ 30 min. b. 也可以取上述試管，加入和培養(yǎng)液一半的6%的萘酚，搖勻，再加入培養(yǎng)液1/3的40%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，觀察結(jié)果?！?3) 媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。實驗結(jié)果及討論針對實驗原理、步驟、現(xiàn)象進行討論。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。因此，應將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整PH。試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙， pH試紙(pH ~)，棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。在這些培養(yǎng)基中，就營養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無機鹽、生長因子及水等幾大類。E. 用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標本。B. 調(diào)節(jié)光源，對光時應避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。如光線入射角為120176。223。 利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。而在0．42μm以下的兩點之間的距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。(3) 高倍鏡觀察 將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。實驗目的1. 明確培養(yǎng)基的配制原理。7H2O FeSO4同時．需不斷攪拌．以防瓊脂糊底燒焦。 圖11 培養(yǎng)基的分裝 A 漏斗分裝裝置 ；B 自動分裝裝置 1 鐵架 ；2 漏斗 ；3孔膠管 ；4彈簧夾 ；5玻璃 ；6流速調(diào)節(jié) ；7 裝量調(diào)節(jié) ；8開關分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。待所有藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。堿性染料初染液的作用象在細菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫。革蘭氏染色過程：5. 實驗作業(yè)(1) 在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌？(2) 作革蘭氏染色涂片為什么不能過于濃厚？其染色成敗的關鍵一步是什么？當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術操作正確，結(jié)果可靠？實驗四 乙酰甲基甲醇試驗()一、實驗目的了解鑒別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗原理，并掌握其操作方法二、原理某些細菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合、脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，(+)反應。 實驗六 吲哚試驗一、實驗目的掌握吲哚試驗(Ehrlich法)的原理和方法：學習吲哚試驗(Ehrlich法)試驗的操作技術。三、實驗材料 (1)菌種 大腸桿菌(Esch~ichiacoli)，愛得華氏菌（Edwardsiella sp） (2)培養(yǎng)基 ONPG培養(yǎng)基 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。如兩種培