【正文】 食品微生物實驗指導(dǎo)劉后偉、林丹瓊、劉旭光適合專業(yè)：綠色食品加工專業(yè) 食品營養(yǎng)與檢測專業(yè) 農(nóng)產(chǎn)品檢測專業(yè)實訓(xùn)一 顯微鏡的操作與使用實驗1: 顯微鏡的構(gòu)造、性能和使用方法1. 目的要求(1) 熟悉普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造及各部分的功能。(2) 學(xué)習(xí)并掌握油鏡的原理和使用方法。2. 基本原理顯微鏡由機(jī)械裝置和光學(xué)系統(tǒng)兩大部分組成。223。 油鏡物鏡的基本原理 微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10）、高倍物鏡（4mm，40—45）和油鏡（1．8 mm，95—100）三種。油鏡通常標(biāo)有黑圈或紅圈，也有的以“OI字樣表示，它是三者中放大倍數(shù)最大的。根據(jù)使用不同放大倍數(shù)的目鏡，可使被檢物體放大1000—2 000多倍。油鏡的焦距和工作距離（標(biāo)本在焦點上看得最清晰時，物鏡與樣品之間的距離）最短，光圈則開得最大，因此，在使用油鏡觀察時，鏡頭離標(biāo)本十分近，需特別小心。使用時，油鏡與其他物鏡的不同是載玻片與物鏡之間不是隔一層空氣，而是隔一層油質(zhì)，稱為油浸系。這種油常選用香柏油，因香柏油的折射率n=1．52，與玻璃相同。當(dāng)光線通過載玻片后，可直接通過香柏油進(jìn)入物鏡而不發(fā)生折射。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。 利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因為顯微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。所謂數(shù)值孔徑，即光線投射到物鏡上的最大角度（稱為鏡口角）的一半正弦，乘上玻片與物鏡間介質(zhì)的折射率所得的乘積，可用下列公式表示：NA＝nsinα 式中 NA=數(shù)值孔徑； n=介質(zhì)折射率； α=最大入射角的半數(shù)，即鏡口角的半數(shù)。 因此，光線投射到物鏡的角度愈大，顯微鏡的效能就愈大（圖Ⅲ5），該角度的大小決定于物鏡的直徑和焦距。同時，α的理論限度為90176。，sin90176。=1，故以空氣為介質(zhì)時（n=1），數(shù)值孔徑不能超過1，如以香柏油為介質(zhì)時，則n增大，其數(shù)值孔徑也隨之增大。如光線入射角為120176。，其半數(shù)的正弦為sin60176。=0．87，則： 以空氣為介質(zhì)時： NA=10．87=0．87 以水為介質(zhì)時： NA=1．330．87=1．15 以香柏油為介質(zhì)時： NA=1．520．87=1．32 顯微鏡的分辨力是指顯微鏡能夠辨別兩點之間最小距離的能力。它與物鏡的數(shù)值孔徑成正比，與光波長度成反比。因此，物鏡的數(shù)值孔徑愈大，光波波長越短，則顯微鏡的分辨力愈大，被檢物體的細(xì)微結(jié)構(gòu)也愈能明晰地區(qū)別出來。因此，一個高的分辨力意味著一個小的可分辨距離，這兩個因素是成反比關(guān)系的，通常有人把分辨力說成是多少微米或納米，這實際上是把分辨力和最小分辨距離混淆起來了。顯微鏡的分辨力是用可分辨的最小距離來表示的。 式中λ=光波波長。 我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L度為0．55μm，假如數(shù)值孔徑為0．65的高倍物鏡，它能辨別兩點之間的距離為0．42μm。而在0．42μm以下的兩點之間的距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用數(shù)值孔徑更大的物鏡，增加其分辨力才行。例如用數(shù)值孔徑為1．25的油鏡時，能辨別兩點之間的 因此，我們可以看出，假如采用放大率為40倍的高倍物鏡（NA=0．65），和放大率為24倍的目鏡，雖然總放大率為960倍，但其分辨的最小距離只有0．42μm。假如采用放大率為90倍的油鏡（NA=1．25），和放大率為9倍的目鏡，雖然總的放大率為810倍，但卻能分辨出0．22μm間的距離。3. 材料及器材顯微鏡、擦鏡紙、二甲苯、香柏油、微生物制片標(biāo)本等。4. 方法與步驟(1) 觀察前的準(zhǔn)備A. 置顯微鏡于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距實驗臺邊沿約3—4cm。鏡檢者姿勢要端正，一般用左眼觀察，右眼便于繪圖或記錄，兩眼必須同時睜開，以減少疲勞，亦可練習(xí)左右眼均能觀察。B. 調(diào)節(jié)光源，對光時應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。如陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。 調(diào)節(jié)光源時，先將光圈完全開放，升高聚光鏡至與載物臺同樣高，否則使用油鏡時光線較暗。然后轉(zhuǎn)下低倍鏡觀察光源強(qiáng)弱，調(diào)節(jié)反光鏡，光線較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡；光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡。在對光時，要使全視野內(nèi)為均勻的明亮度。凡檢查染色標(biāo)本時，光線應(yīng)強(qiáng)；檢查未染色標(biāo)本時，光線不宜太強(qiáng)。可通過擴(kuò)大或縮小光圈、升降聚光器、旋轉(zhuǎn)反光鏡調(diào)節(jié)光線。(2) 低倍鏡觀察 檢查的標(biāo)本需先用低倍鏡觀察，因為低倍鏡視野較大，易發(fā)現(xiàn)目標(biāo)和確定檢查的位置。 將金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本置鏡臺上，用標(biāo)本夾夾住，移動推動器，使觀察對象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使物鏡降至距標(biāo)本約 0．5cm處，由目鏡觀察，此時可適當(dāng)?shù)乜s小光圈，否則視野中只見光亮一片，難見到目的物，同時用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚時為止，然后移動標(biāo)本，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準(zhǔn)備用高倍鏡觀察。(3) 高倍鏡觀察 將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。然后由目鏡觀察，并仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜，同時用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒至物像出現(xiàn)后，再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)至物像清晰為止，找到最適宜觀察的部位后，將此部位移至視野中心，準(zhǔn)備用油鏡觀察。(4) 油鏡觀察A. 用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒提起約2cm，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。B. 在玻片標(biāo)本的鏡檢部位滴上一滴香柏油。C. 從側(cè)面注視，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒小心地降下，使油鏡浸在香柏油中，其鏡頭幾乎與標(biāo)本相接，應(yīng)特別注意不能壓在標(biāo)本上，更不可用力過猛，否則不僅壓碎玻片，也會損壞鏡頭。D. 從接目鏡內(nèi)觀察，進(jìn)一步調(diào)節(jié)光線，使光線明亮，再用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升，直至視野出現(xiàn)物像為止，然后用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距。如油鏡已離開油面而仍未見物像，必須再從側(cè)面觀察，將油鏡降下，重復(fù)操作至物像看清為止。E. 用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標(biāo)本。F. 觀察完畢，上旋鏡筒。先用擦鏡紙拭去鏡頭上的油，然后用擦鏡紙蘸少許二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去鏡頭上殘留油跡，最后再用干凈擦鏡紙擦去殘留的二甲苯。切忌用手或其他紙擦鏡頭，以免損壞鏡頭。用綢布擦凈顯微鏡的金屬部件。G. 將各部分還原，反光鏡垂直于鏡座，將接物鏡轉(zhuǎn)成八字形，再向下旋。同時把聚光鏡降下，以免接物鏡與聚光鏡發(fā)生碰撞危險。5. 實驗作業(yè)(1) 分別繪出你在低倍鏡、高倍鏡和油鏡下觀察到的金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的狀態(tài)，包括在三種情況下視野中的變化，同時注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率。(2) 在使用高倍鏡和油鏡進(jìn)行調(diào)焦時，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？(3) 用油鏡觀察時，為什么要在載玻片上滴加香柏油？實訓(xùn)二 培養(yǎng)基的配制和滅菌實驗?zāi)康?. 明確培養(yǎng)基的配制原理。2. 掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。實驗內(nèi)容學(xué)習(xí)細(xì)菌、放線菌、酵母菌及霉菌四大類微生物培養(yǎng)基的配制。實驗原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。各類微生物對營養(yǎng)的要求不盡相同，因而培養(yǎng)基的種類繁多。培養(yǎng)細(xì)菌常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)放線菌常用高氏I號培養(yǎng)基，培養(yǎng)霉菌常用蔡氏培養(yǎng)基或馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)酵母菌常用麥芽汁培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基。另外還有固體、液體、加富、選擇、鑒別等培養(yǎng)基之分。在這些培養(yǎng)基中，就營養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子及水等幾大類。瓊脂只是固體培養(yǎng)基的支持物，一般不為微生物所利用。它在96℃以上熔化成液體，而在45℃左右開始凝固成固體。在配制培養(yǎng)基時，根據(jù)各類微生物的特點，就可以配制出適合不同種類微生物生長發(fā)育所需要的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基除了滿足微生物所必需營養(yǎng)物質(zhì)外，還要求有一定的酸堿度和滲透壓。霉菌和酵母菌的pH偏酸；細(xì)菌、放線菌的pH為微堿性。所以每次配制培養(yǎng)基時，都要將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到一定的范圍。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方牛肉膏 g蛋白胨 NaCl 水 1000mLpH ~高氏I號培養(yǎng)基配方可溶性淀粉 20gNaCl KNO3 1gK2HPO43H2O MgSO47H2O FeSO47H2O 瓊脂 15—25g水 1000mL pH ~馬鈴薯培養(yǎng)基配方馬鈴薯（去皮） 200g葡萄糖（或蔗糖） 20g瓊脂 15~25g水 1000ml自然pH察氏培養(yǎng)基配方蔗糖 30gNaNO3 2gK2HPO4 1gKCl MgSO47H2O FeSO47H2O 瓊脂 15~25g蒸餾水 1000ml自然pH實驗及器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，瓊脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl，KNO3，K2HPO43H2O，MgSO47H2O，F(xiàn)eS047H2O，馬鈴薯，蔗糖等。試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙， pH試紙(pH ~)，棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。實驗步驟1．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法(1) 稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可按在稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。蛋白胨很易吸濕，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴(yán)防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯。(2) 溶化：在上述燒杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解。將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積，如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放入己溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。在瓊脂溶化過程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時．需不斷攪拌．以防瓊脂糊底燒焦。配制培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影晌細(xì)菌生長。(3) 調(diào)pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入1mol/LNaOH,邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH。反之，用mol/LHCL進(jìn)行調(diào)節(jié)。 對于有些要求pH較精確的微生物，其pH的調(diào)節(jié)可用酸度計進(jìn)行。 pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時，若預(yù)先調(diào)好pH并在高壓蒸氣下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整PH。(4) 過濾 趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實驗結(jié)果的觀察。一般無特殊要求的情況下可以省去（本實驗勿需過濾）。(5) 分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝人試管內(nèi)或三角燒瓶內(nèi)。1) 液體分裝：分裝高度以試管高度的l／4左右為宜。分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ)加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。2) 固體分裝：分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。3) 半固體分裝：試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。 圖11 培養(yǎng)基的分裝 A 漏斗分裝裝置 ；B 自動分裝裝置 1 鐵架 ；2 漏斗 ；3孔膠管 ；4彈簧夾 ；5玻璃 ；6流速調(diào)節(jié) ；7 裝量調(diào)節(jié) ；8開關(guān)分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。(6) 加塞圖12 棉塞的制作培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及試管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使培養(yǎng)在里面的微生物能夠從外界源源不斷地獲得新鮮無菌空氣。因此棉塞質(zhì)量的好壞對實驗的結(jié)果有著很大的影響。一只好的棉塞，外形應(yīng)象一只蘑菇，大小、松緊都應(yīng)適當(dāng)。加塞時的棉塞的總長度的3/5應(yīng)在口內(nèi)，2/5在口外。 (7) 包扎 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。(8) 滅菌 ，121℃，20min高壓蒸氣滅菌。(9) 擱置斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50℃左右〔以防斜面上