【正文】 羧酶陽(yáng)性，甲型副傷寒沙門(mén)氏菌為賴氨酸脫羧酶陰性。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 均質(zhì)器及無(wú)菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳體。 %纖維二糖發(fā)酵管：。：液體樣品應(yīng)先將其充分搖勻后以無(wú)菌吸管吸取樣品25mL放人裝有225mL生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分振搖，制成1：10的樣品勻液。從樣品稀釋到平板涂布整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程要求在20min內(nèi)完成?！妗?℃條件下解凍，時(shí)間不超過(guò)18h，也可在溫度不超過(guò)45℃的條件下解凍，時(shí)間不超過(guò)15min。 MC（modified chalmers）培養(yǎng)基：。1℃。2 規(guī)范性引用文件 下列文件中的條款通過(guò)本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。 5. 4. 2. 2 反應(yīng)序號(hào)A2：補(bǔ)做甘露醇和山梨醇試驗(yàn)，沙門(mén)氏菌靛基質(zhì)陽(yáng)性變體兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，但需要結(jié)合血清學(xué)鑒定結(jié)果進(jìn)行判定。1℃培養(yǎng)18 h~24 h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48 h，按表3判定結(jié)果。接種針不要滅菌，直接接種賴氨酸脫梭酶試驗(yàn)培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36℃士1℃培養(yǎng) 18 h~24 h，必要時(shí)可延長(zhǎng)至48 h。若樣品 為液態(tài)，不需要均質(zhì)，振蕩混勻。 3. 17 沙門(mén)氏菌O和H診斷血清。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可使用這些等效的產(chǎn)品。 3. 6 木糖賴氨酸脫氧膽鹽XLD)瓊脂:見(jiàn)第A. 6章。感量0. 1 g 2. 6 無(wú)菌錐形瓶:容量500 ml,250 ml 2. 7 無(wú)菌吸管:1 ml(具0. 0lml，刻度),10 ml()或微量移液器及吸頭。稀釋液：，用蒸餾水稀釋至1000ml，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15min。則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告；如果所有稀釋度的測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告；如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。2h。 第三法 大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法9 檢驗(yàn)程序 大腸菌群PetrifilmTM測(cè)試片法的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖3檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì)10倍系列稀釋選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種PetrifilmTM測(cè)試片36℃＋1℃ 24h177。1℃培養(yǎng)18h～24h。 第二法 大腸菌群平板計(jì)數(shù)7 檢驗(yàn)程序 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的檢驗(yàn)程序見(jiàn)下圖 2檢樣25g（或25mL）樣品＋225mL稀釋液，均質(zhì) 10倍系列稀釋選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液，接種VRBA平板 36℃＋1℃ 48h177。2h。 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)與之適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，置盛1：10的樣品勻液。————————— Pctrifilm tm是由3M公司提供的產(chǎn)品的商品名，給出這一個(gè)薪資是為了方便本標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。 無(wú)菌錐形瓶：容量500mL。1℃。 稀釋液： mL，用蒸餾水稀釋至l 000 mL，分裝于適宜容器中，121℃高壓滅菌15 min。選取菌落數(shù)在30 300 之間的測(cè)試片計(jì)數(shù)。9 操作步驟 樣品的稀釋 制備1:10 的樣品勻液后，用1 mol/L 氫氧化鈉（NaOH ）或1 mol/L 鹽酸( HCL ）調(diào)節(jié)pH 。，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)（包括液體樣品原液）的平板均無(wú)菌落數(shù)生成，則以少于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的可記錄為多不可計(jì)。1℃培養(yǎng)48h177。用1ml無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1ml，沿管壁緩慢注于盛有9ml稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用一支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。4. 3 無(wú)菌生理鹽水：，121℃高壓滅菌15min。1℃. 天平：. 均質(zhì)器。本標(biāo)準(zhǔn)適用于各類食品中菌落總數(shù)的測(cè)定。2)學(xué)習(xí)過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)的操作技術(shù)。 (2)學(xué)習(xí)淀粉水解試驗(yàn)的操作技術(shù)。四、方法與步驟以劃線接種法將試驗(yàn)菌接種于酪蛋白培養(yǎng)基上，然后置37℃恒溫箱培養(yǎng)1—2d后，觀察結(jié)果五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果平板中菌落周圍有透明圈者，為酪蛋白分解試驗(yàn)陽(yáng)性。3） 接種 用無(wú)菌接種環(huán)分別取大腸桿菌菌液一環(huán)，在對(duì)應(yīng)的葡萄糖銨斜面培養(yǎng)基和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上劃線接種，并以同樣的方法接種福氏志賀菌。實(shí)驗(yàn)五 葡萄糖銨試驗(yàn)—、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)了解葡萄糖銨試驗(yàn)的用途及原理。如兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況差別不明顯，可在同一培養(yǎng)基上連續(xù)移種三次，如差別仍不明顯，則為陰性。因碳?xì)浠衔锊蝗苡谒?，可在液體中撮搞培養(yǎng)或加入45℃左右的固體培養(yǎng)基中，用力振蕩后立即倒成平板。三、實(shí)驗(yàn)材料 (1)菌種 大腸桿菌(Esch~ichiacoli)，愛(ài)得華氏菌（Edwardsiella sp） (2)培養(yǎng)基 ONPG培養(yǎng)基 (3)其它 酒精棉球，酒精燈，接種針，恒溫箱等。取裝有蛋白胨水培養(yǎng)基的試管3支，分別標(biāo)記大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和空白對(duì)照。 實(shí)驗(yàn)六 吲哚試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆者胚嵩囼?yàn)(Ehrlich法)的原理和方法：學(xué)習(xí)吲哚試驗(yàn)(Ehrlich法)試驗(yàn)的操作技術(shù)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V．P試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)(用“+”表示)；若不呈紅色，記錄為V．P試驗(yàn)陰性反應(yīng)(用“”表示)。革蘭氏染色過(guò)程：5. 實(shí)驗(yàn)作業(yè)(1) 在你所作的革蘭氏染色制片中，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌各染成何色？它們是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽(yáng)性菌？(2) 作革蘭氏染色涂片為什么不能過(guò)于濃厚？其染色成敗的關(guān)鍵一步是什么？當(dāng)你對(duì)一株未知菌進(jìn)行革蘭氏染色時(shí)，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？實(shí)驗(yàn)四 乙酰甲基甲醇試驗(yàn)()一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私忤b別不同腸桿菌科各菌屬的乙酰甲基甲醇試驗(yàn)原理，并掌握其操作方法二、原理某些細(xì)菌在葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合、脫羧成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的胍基生成紅色化合物，(+)反應(yīng)?！?4) 脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約20—30秒鐘，立即用水沖凈酒精。堿性染料初染液的作用象在細(xì)菌的單染色法基本原理中所述的那樣，而用于革蘭氏染色的初染液一般是結(jié)晶紫。實(shí)驗(yàn)作業(yè)（選做3題）1．牛肉膏應(yīng)置于何種容器中稱量為宜?2．配制高氏合成一號(hào)培養(yǎng)基時(shí)，可溶性淀粉需經(jīng)什么處理后才能倒入到沸水中? 3．何謂培養(yǎng)基的自然pH?4．培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌?如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無(wú)菌的5．在配制培養(yǎng)基的操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題?為什么?6．配制合成培養(yǎng)基加入微量元素時(shí)最好用什么方法加入?天然培養(yǎng)基為什么不需要另加微量元素?7．有人認(rèn)為自然環(huán)境中微生物是生長(zhǎng)在不按比例的基質(zhì)中，為什么在配制培養(yǎng)基時(shí)要注意各種營(yíng)養(yǎng)成分的比例?8．你配制的高氏I號(hào)培養(yǎng)基有沉淀產(chǎn)生嗎?說(shuō)明產(chǎn)生或未產(chǎn)生的原因。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。(8) 滅菌 ，121℃，20min高壓蒸氣滅菌。 圖11 培養(yǎng)基的分裝 A 漏斗分裝裝置 ；B 自動(dòng)分裝裝置 1 鐵架 ；2 漏斗 ；3孔膠管 ；4彈簧夾 ；5玻璃 ；6流速調(diào)節(jié) ；7 裝量調(diào)節(jié) ；8開(kāi)關(guān)分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。(4) 過(guò)濾 趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。同時(shí)．需不斷攪拌．以防瓊脂糊底燒焦。實(shí)驗(yàn)步驟1．牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制方法(1) 稱量：按培養(yǎng)基配方比例依次推確地稱取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人燒杯中。7H2O FeSO4瓊脂只是固體培養(yǎng)基的支持物，一般不為微生物所利用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 明確培養(yǎng)基的配制原理。F. 觀察完畢，上旋鏡筒。(3) 高倍鏡觀察 將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，在轉(zhuǎn)換物鏡時(shí)，需用眼睛在側(cè)面觀察，避免鏡頭與玻片相撞。如陰暗天氣，可用日光燈或顯微鏡燈照明。而在0．42μm以下的兩點(diǎn)之間的距離就分辨不出，即使用倍數(shù)更大的目鏡，使顯微鏡的總放大率增加，也仍然分辨不出。其半數(shù)的正弦為sin60176。 利用油鏡不但能增加照明度，更主要的是能增加數(shù)值孔徑，因?yàn)轱@微鏡的放大效能是由其數(shù)值孔徑?jīng)Q定的。 油鏡物鏡的基本原理 微生物學(xué)研究用的顯微鏡的物鏡通常有低倍物鏡（16mm，10）、高倍物鏡（4mm，40—45）和油鏡（1．8 mm，95—100）三種。223。如果玻片與物鏡之間的介質(zhì)為空氣，則稱為干燥系，當(dāng)光線通過(guò)玻片后，受到折射發(fā)生散射現(xiàn)象，進(jìn)入物鏡的光線顯然減少，這樣就減低了視野的照明度。如光線入射角為120176。 我們?nèi)庋鬯芨惺艿墓獠ㄆ骄L(zhǎng)度為0．55μm，假如數(shù)值孔徑為0．65的高倍物鏡，它能辨別兩點(diǎn)之間的距離為0．42μm。B. 調(diào)節(jié)光源，對(duì)光時(shí)應(yīng)避免直射光源，因直射光源影響物像的清晰，損壞光源裝置和鏡頭，并刺激眼睛。 將金黃色葡萄球菌染色標(biāo)本置鏡臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，移動(dòng)推動(dòng)器，使觀察對(duì)象處在物鏡正下方，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器，使物鏡降至距標(biāo)本約 0．5cm處，由目鏡觀察，此時(shí)可適當(dāng)?shù)乜s小光圈，否則視野中只見(jiàn)光亮一片，難見(jiàn)到目的物，同時(shí)用粗調(diào)節(jié)器慢慢升起鏡筒，直至物像出現(xiàn)后再用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物像清楚時(shí)為止，然后移動(dòng)標(biāo)本，認(rèn)真觀察標(biāo)本各部位，找到合適的目的物，并將其移至視野中心，準(zhǔn)備用高倍鏡觀察。E. 用同樣的方法觀察枯草芽孢桿菌染色標(biāo)本。(2) 在使用高倍鏡和油鏡進(jìn)行調(diào)焦時(shí)，應(yīng)將鏡筒徐徐上升還是下降？為什么？(3) 用油鏡觀察時(shí)，為什么要在載玻片上滴加香柏油？實(shí)訓(xùn)二 培養(yǎng)基的配制和滅菌在這些培養(yǎng)基中，就營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而言，一般不外乎碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子及水等幾大類。3H2O MgSO4試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，天平，牛角匙， pH試紙(pH ~)，棉花，牛皮紙，記號(hào)筆，麻繩，紗布等。在瓊脂溶化過(guò)程中，應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。因此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開(kāi)滅菌后再混合，或在中性pH條件下滅菌，再調(diào)整PH。3) 半固體分裝：試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時(shí)容易解開(kāi)，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、配制日期。／ml， g／m1的貯備液即可。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論針對(duì)實(shí)驗(yàn)原理、步驟、現(xiàn)象進(jìn)行討論。 革蘭氏染色需用四種不同的溶液：堿性染料初染液；媒染劑；脫色劑和復(fù)染液?！?3) 媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。此外，菌齡也影響染色結(jié)果，如陽(yáng)性菌培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應(yīng)。另取5支空試管相應(yīng)標(biāo)記菌名，分別加入35 mL以上對(duì)應(yīng)管中的培養(yǎng)液，再加入400 g／L氫氧化鈉溶液10~20滴，~1 mg微量肌酸，振蕩試管，以使空氣中的氧溶人，置37℃恒溫箱中保溫15℃ 30 min. b. 也可以取上述試管，加入和培養(yǎng)液一半的6%的萘酚，搖勻，再加入培養(yǎng)液1/3的40%氫氧化鈉溶液，充分搖勻，觀察結(jié)果。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 若培養(yǎng)液上層變成紅色, 即為陽(yáng)性反應(yīng)；若仍呈黃色，則為陰性反應(yīng)，分別用“+”或“”表示。四、方法與步驟標(biāo)記試管→接種→培養(yǎng)→觀察→記錄。當(dāng)試驗(yàn)產(chǎn)生β半乳糖苷酶時(shí)，鄰硝基酚βD半乳糖苷被水解，釋放出鄰硝基酚，此物為酸堿指示劑，(無(wú)色)→(黃色)，否則不變色。糖的含量一般為l％，醇類、％％，％。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果凡測(cè)定菌在有碳水化合物的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況明顯超過(guò)在空白基礎(chǔ)培養(yǎng)基的生長(zhǎng)量者為陽(yáng)性，否則為陰性。將觀察結(jié)果以表格方式記錄。要求每一接種環(huán)內(nèi)含菌數(shù)在20—100個(gè)為宜（或肉眼觀察不見(jiàn)渾濁）。(2) 培養(yǎng)基 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基平板(附錄Ⅲ—19)(3) 其它 酒精棉球，酒精燈，接種環(huán)，恒溫箱等。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在兩分鐘內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)色者為陽(yáng)性，2min以后出現(xiàn)微弱或可疑反應(yīng)者均作為陰性結(jié)果. 實(shí)驗(yàn)九 淀粉水解試驗(yàn) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? (1)了解淀粉水解試驗(yàn)的原理及用途。實(shí)驗(yàn)八 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)—，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?)了解過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)的用途與原理。菌落總數(shù)測(cè)定1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中菌落總數(shù)的測(cè)定方法。 冰箱：2℃~5℃. 恒溫水浴箱：46℃177。4. 2 磷酸鹽緩沖液：見(jiàn)第A..2章。液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25ml樣品置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻,制成1：10的樣品勻液。培養(yǎng) 瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃177。 選取菌落數(shù)在30CPU~300CPU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。示例： 稀釋度1；100（第一稀釋度）1；100（第二稀釋度）菌落數(shù)232，24433，35，則對(duì)所有稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)數(shù)。第二法菌落總數(shù)Petrifilm TM測(cè)試片法8 檢驗(yàn)程序除將平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基改成PetrifilmTM 菌落總數(shù)測(cè)試片外，其他與第5 章相同。 計(jì)數(shù) 培養(yǎng)結(jié)束后立即計(jì)數(shù)，可肉眼觀察計(jì)數(shù)，或用菌落計(jì)數(shù)器、放大鏡、PetrifilmTM 自動(dòng)判讀儀計(jì)數(shù)。分裝試管或錐形瓶，